提高菜心真空滲入轉(zhuǎn)基因效率的研究.pdf

1、真空滲入作為植物原位轉(zhuǎn)化的一種方法，是白菜類作物中迄今為止所用得最多的不依賴于組織培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化方法。真空滲入轉(zhuǎn)基因方法在白菜類作物上的應(yīng)用研究雖然已有較多相關(guān)報(bào)道，但仍存在一些問(wèn)題。一方面，真空滲入轉(zhuǎn)化效率不穩(wěn)定且普遍較低。另一方面，真空度、滲入時(shí)間、植物發(fā)育時(shí)期、農(nóng)桿菌濃度、滲入介質(zhì)的表面活性劑與蔗糖含量等條件以及各因素之間的共同作用對(duì)植物轉(zhuǎn)化率影響程度尚不明確，使得真空滲入轉(zhuǎn)化技術(shù)難以進(jìn)一步擴(kuò)大應(yīng)用范圍。
　　本研究以‘油青四九

2、’菜心（Brassica campastris ssp.chinensis var.parachinensis‘Youqing49’）為轉(zhuǎn)基因受體材料，以攜帶有pCAMBIA1301載體的GV3101農(nóng)桿菌為供體材料，針對(duì)農(nóng)桿菌菌液OD600、植株發(fā)育時(shí)期、壓強(qiáng)與時(shí)間、表面活性劑Silwet L-77的濃度及蔗糖濃度對(duì)‘油青四九’真空滲入轉(zhuǎn)化率的影響進(jìn)行了單因素研究，分析各因素對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響。隨后對(duì)菌液OD600、壓強(qiáng)與時(shí)間、表面活性劑

3、Silwet L-77的濃度及蔗糖濃度進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定菜心真空滲入轉(zhuǎn)化的最佳體系。此外，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株上下部收種和雜交授粉實(shí)驗(yàn)分析原位轉(zhuǎn)化在花序中發(fā)生頻率較高的部位與時(shí)間。得到的主要結(jié)果如下:
　　(1)對(duì)處于三種不同發(fā)育時(shí)期的菜心進(jìn)行真空滲入轉(zhuǎn)化，分析發(fā)育時(shí)期對(duì)菜心真空滲入轉(zhuǎn)化的影響。其中處理初花期的植株得到了約0.1％的種子轉(zhuǎn)化率，高于處于現(xiàn)蕾期和側(cè)薹初花期的菜心轉(zhuǎn)化率，但三者并沒(méi)有顯著差異。處于側(cè)薹發(fā)育期的菜心植株轉(zhuǎn)

4、化率是主薹初花期和蕾期的1.8倍和3倍，表明真空滲入處理菜心的適宜時(shí)期是側(cè)薹發(fā)育期。
　　(2)對(duì)不同濃度的菌液處理得到的轉(zhuǎn)化率分析結(jié)果表明，菌液濃度對(duì)轉(zhuǎn)化事件有顯著影響。在0.0025～0.4000的不同OD600處理中，菌液吸光度值在0.2時(shí)獲得了高達(dá)0.12％的種子轉(zhuǎn)化率。
　　(3)對(duì)不同壓強(qiáng)和時(shí)間處理的轉(zhuǎn)化率統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，壓強(qiáng)與時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效果有極顯著的影響。其中壓強(qiáng)為10 kPa，滲入處理時(shí)間為5 min時(shí)獲得了最

5、高的轉(zhuǎn)化率。
　　(4)通過(guò)對(duì)表面活性劑Silwet L-77四種不同濃度的處理，發(fā)現(xiàn)0.0025％，0.005％，0.01％和0.02％的Silwet L-77對(duì)菜心真空滲入轉(zhuǎn)化影響顯著，處理菜心最適宜的濃度為0.01％。
　　(5)通過(guò)對(duì)不同的蔗糖濃度處理獲得轉(zhuǎn)化率的顯著性分析發(fā)現(xiàn)，不同濃度的蔗糖處理得到的轉(zhuǎn)化率差異不顯著。蔗糖含量為3％時(shí)可以得到更好的轉(zhuǎn)化效果。
　　(6)對(duì)影響菜心真空滲入轉(zhuǎn)化的菌液濃度、滲入時(shí)

6、間、轉(zhuǎn)化介質(zhì)中表面活性劑和蔗糖含量進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到適宜菜心真空滲入轉(zhuǎn)化的體系為:菜心處于側(cè)薹初花期，處理壓強(qiáng)10 kPa，滲入時(shí)間為5.5 min，菌液吸光度值為0.2，轉(zhuǎn)化介質(zhì)中表面活性劑與蔗糖的含量分別為0.0125％和3％。
　　(7)通過(guò)對(duì)真空滲入轉(zhuǎn)化菜心植株與野生型植株的不同雜交方式獲得轉(zhuǎn)化率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，真空滲入處理植株作為父本時(shí)，母本為野生型的植株得到了0.0039％種子轉(zhuǎn)化率，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于真空滲入處理植株作為母