初步探討自然衰老小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)行為及β-catenin對(duì)其分化功能的影響.pdf

1、隨著老年人在世界人口的比例大幅增加,老齡化疾病越來越受到人們的重視。其中骨質(zhì)疏松癥是一種老年人常見的疾病,其特點(diǎn)是骨組織低骨量和顯微結(jié)構(gòu)的惡化。這種疾病的發(fā)生極大增加了老年人骨折的風(fēng)險(xiǎn)。隨著社會(huì)人口老齡化,衰老型骨質(zhì)疏松癥及所導(dǎo)致的骨折已成為一個(gè)日益重要的健康和社會(huì)問題。在動(dòng)物體內(nèi)骨骼是一個(gè)不斷變化的過程,骨吸收再重塑并替換為新骨。在年輕人體內(nèi)中,骨總體數(shù)量的吸收,并形成新骨是平衡的。然而,隨年齡增長這種重構(gòu)平衡被打破,最終導(dǎo)致骨量減少

2、,骨強(qiáng)度降低,進(jìn)而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生增加骨折的風(fēng)險(xiǎn)。其中股骨骨折極易受到骨質(zhì)疏松癥的影響。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSCs)是從骨髓組織中提取出來的,數(shù)量非常稀少,但其存在的意義是非常重大的。它具有多向分化功能,以維持骨組織的自我更新,新骨替換舊骨能力。然而衰老狀態(tài)下BMMSCs的生物學(xué)行為和骨組織的再生能力的相關(guān)報(bào)道較少。
　　許多信號(hào)通路調(diào)節(jié)干細(xì)胞的分化方向和數(shù)目,Wnt信號(hào)通路作為其中一種信號(hào)通路對(duì)骨組織改建和新骨形成發(fā)揮了

3、重要作用,β–catenin(β–連環(huán)蛋白)也是決定干細(xì)胞向成脂或成骨方向分化轉(zhuǎn)換的重要調(diào)控分子。
　　通過前期實(shí)驗(yàn),我們檢測到衰老組織來源的BMMSCs低表達(dá)β-catenin,提示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路可能與衰老狀態(tài)下BMMSCs的成骨或成脂分化有關(guān)。我們假設(shè):衰老環(huán)境可以使β-catenin發(fā)生改變,進(jìn)而導(dǎo)致Wnt/β-catenin信號(hào)通路受抑制,使成骨表達(dá)下降。
　　目的:
　　1.探討自然衰老對(duì)

4、小鼠骨質(zhì)特征的影響。
　　2.分離并提取自然衰老小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　3.檢測自然衰老是否對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和分化能力產(chǎn)生了影響。
　　4.檢測在衰老環(huán)境下β-catenin是否發(fā)生了變化,過表達(dá)β-catenin后對(duì)自然衰老來源的BMMSCs的生物學(xué)功能產(chǎn)生影響。
　　方法:
　　1.取2月齡和12月齡C57BL/6J小鼠各20只,利用Micro-CT三維立體掃描技術(shù)分別對(duì)每只小鼠的后肢股骨骭

5、骺端處進(jìn)行掃描,觀察分析兩組小鼠股骨骭骺端的骨密度及骨小梁相關(guān)指標(biāo)數(shù)值的變化。
　　2.將兩組小鼠脫頸處死后,剝?nèi)∑涔晒呛兔劰呛?剪去兩端骨組織。利用密度梯度離心法,貼壁法培養(yǎng)出純度較高的BMMSCs,并且采用流式對(duì)干細(xì)胞表面分子進(jìn)行鑒定和細(xì)胞凋亡狀態(tài)的檢測。SA-β-半乳糖苷酶染色方法檢測兩組衰老相關(guān)酶表達(dá)變化。
　　3.采用MTT方法對(duì)兩組細(xì)胞增殖能力進(jìn)行對(duì)比;克隆形成方法研究兩組細(xì)胞自我更新能力;通過茜素紅染色和油紅O

6、染色及Real-timePCR的方法研究兩組細(xì)胞成骨和成脂分化能力的對(duì)比。
　　4.通過Real-timePCR和Westernblot實(shí)驗(yàn)觀察兩組不同來源細(xì)胞中β-catenin表達(dá)的差異。并且構(gòu)建β-catenin質(zhì)粒載體,將實(shí)驗(yàn)分為四組2月齡組;2月齡+成骨/成脂誘導(dǎo)組;12月齡+成骨/成脂誘導(dǎo)組;12月齡+轉(zhuǎn)染+成骨/成脂誘導(dǎo)。分別對(duì)這四組進(jìn)行茜素紅染色,油紅O染色和Real-timePCR和Westernblot實(shí)驗(yàn)方法

7、,研究其分化功能的差異。
　　結(jié)果:
　　1.兩組小鼠股骨經(jīng)Micro-CT掃描和圖像研究顯示:12月齡小鼠股骨骭骺端的松質(zhì)骨較2月齡組密度減低,骨密度下降。兩組骨小梁參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析表明:12月齡組骨體積比總體積(BV/TV％)值、骨小梁數(shù)量(Tb.N1/mm)和骨密度(BMDmg/mm3)值均明顯低于2月齡組;而骨小梁間距(TbSum)明顯大于2月齡組,兩組間各參數(shù)相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05)。
　　2.

8、我們成功的從兩組小鼠體內(nèi)提取出了BMMSCs。通過實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn):(1)培養(yǎng)初期,細(xì)胞大多為短梭形,傳到P3代后細(xì)胞形態(tài)逐漸均一,為多角形,星型,衰老組BMMSCs形狀較為鋪展,立體形態(tài)差。到P6代,年輕組和衰老組均表現(xiàn)為形態(tài)不規(guī)則,鋪展伸開。由此確定以下試驗(yàn)均用P3~5代細(xì)胞。(2)經(jīng)干細(xì)胞表面分子鑒定顯示衰老組小鼠BMMSCs的干細(xì)胞的特異性表達(dá)標(biāo)記CD90在細(xì)胞表面標(biāo)記,陽性表達(dá)下降明顯,其余表面標(biāo)記表達(dá)無差異。表明本實(shí)驗(yàn)成功從兩組

9、小鼠體內(nèi)提取出了BMMSCs。(3)SA-β-半乳糖苷酶為衰老性標(biāo)記的染色,年輕組僅見少量的SA-β-半乳糖苷酶染色陽性顯示,而衰老組小鼠BMMSCs的SA-β-半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞增多。表明從自然衰老小鼠體內(nèi)提出的BMMSCs的明顯比年輕組的BMMSCs要表現(xiàn)出更明顯的衰老狀態(tài)。(4)細(xì)胞凋亡檢測顯示,12月齡組小鼠BMMSCs凋亡水平明顯高于2月齡組。
　　3.MTT和克隆形成檢測顯示,12月齡組BMMSCs增殖能力和自我更

10、新能力較2月齡組減弱。茜素紅染色顯示,12月齡組礦化結(jié)節(jié)形成數(shù)量低于2月齡組。Real-timePCR檢測顯示,12月齡組BMMSCs成骨誘導(dǎo)后其Runx2mRNA表達(dá)水平明顯低于2月齡組(P<0.05)。油紅O染色顯示12月齡組BMMSCs形成脂滴數(shù)量明顯多于2月齡組小鼠BMMSCs誘導(dǎo)后結(jié)果,經(jīng)Real-timePCR檢測PPAR-r在12月齡組誘導(dǎo)后變化較2月齡組大,且表達(dá)量高于2月齡組誘導(dǎo)后結(jié)果(P<0.05)。
　　4.

11、通過Real-timePCR和Westernblot檢測,在自然衰老小鼠來源的BMMSCs中,β-catenin表達(dá)較年輕組明顯下降。并且過表達(dá)衰老組BMMSCs中的β-catenin后,成骨相關(guān)基因Runx2表達(dá)明顯升高,成脂相關(guān)基因lpl、PPAR-r表達(dá)明顯下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在衰老組BMMSCs中過表達(dá)β-catenin后,其成骨能力上升,成脂能力下降。
　　結(jié)論:
　　1.12月齡小鼠出現(xiàn)了骨衰老癥狀,主要表現(xiàn)為骨密