CaN-NFAT信號通路在應(yīng)力介導(dǎo)的成肌細(xì)胞凋亡中的作用及其作用機(jī)制.pdf

1、目的:頜面部肌肉組織的適應(yīng)性改建在正畸功能矯形中都發(fā)揮了重要作用。成肌細(xì)胞是構(gòu)成頜面部肌肉組織的重要組成部分，是適應(yīng)性改建的主要體現(xiàn)者。目前多數(shù)學(xué)者的研究集中于成肌細(xì)胞的分化、增殖等方面，忽視了成肌細(xì)胞凋亡方面的研究。而成肌細(xì)胞的凋亡與成肌細(xì)胞的分化、增殖一樣，在頜面部肌肉組織的生長和改建中發(fā)揮著重要的作用。本研究通過構(gòu)建成肌細(xì)胞力學(xué)刺激模型研究周期性張應(yīng)力對大鼠L6成肌細(xì)胞凋亡的影響，明確CaN-NFAT信號通路在應(yīng)力介導(dǎo)的大鼠L6成

2、肌細(xì)胞凋亡中的作用，從而闡明功能矯形時(shí)成肌細(xì)胞適應(yīng)性改建的分子機(jī)制，為正畸醫(yī)生治療錯頜畸形提供理論支持。
　　方法:本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用多通道細(xì)胞牽張應(yīng)力加載系統(tǒng)對大鼠L6成肌細(xì)胞構(gòu)建的力學(xué)刺激模型分別施加0h、1h、2h、6h、12h、24h的周期性張應(yīng)力(0h組即為對照組)，加載的力值為15％的細(xì)胞形變率，加載的頻率為10個(gè)循環(huán)/min，每個(gè)循環(huán)均包括3s拉伸和3s松弛;于倒置相差顯微鏡下對成肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變和生長狀況進(jìn)行觀察;經(jīng)過H

3、oechst33258熒光染料染色后，采用熒光顯微鏡觀察凋亡的成肌細(xì)胞;采用流式細(xì)胞術(shù)分別分析各組成肌細(xì)胞的凋亡率;運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)及Westernblot技術(shù)分別檢測周期性張應(yīng)力作用下各組成肌細(xì)胞鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)及NFAT的mRNA和蛋白含量;采用CaN的特異性抑制劑環(huán)孢素(CsA)明確CaN在周期性張應(yīng)力介導(dǎo)的L6成肌細(xì)胞凋亡中的作用，從而進(jìn)一步明確內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與應(yīng)力介導(dǎo)的大鼠L6成肌細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟

4、件SPSS17.0對所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1.大鼠L6成肌細(xì)胞在受到大小為15％細(xì)胞形變率，頻率為10個(gè)循環(huán)/min的周期性張應(yīng)力后，貼壁生長情況良好，細(xì)胞無變性并且脫落率極低，說明成肌細(xì)胞體外培養(yǎng)-力學(xué)刺激模型構(gòu)建成功;
　　2.當(dāng)大鼠L6成肌細(xì)胞受到長時(shí)間的周期性張應(yīng)力作用后，細(xì)胞排列方向由原先的雜亂無章變?yōu)轫槕?yīng)力場方向排列，并且隨著應(yīng)力作用時(shí)間變長，細(xì)胞排列方向變得更加明顯;
　　3.

5、Hoechst33258熒光染色及流式細(xì)胞術(shù)的檢測結(jié)果顯示15％的細(xì)胞形變率，10個(gè)循環(huán)/min的周期性張應(yīng)力誘導(dǎo)大鼠L6成肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，并且在一定的作用時(shí)間范圍內(nèi)，成肌細(xì)胞的凋亡率隨著應(yīng)力作用時(shí)間的延長而升高，在24h達(dá)到高峰;
　　4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測結(jié)果顯示，隨著應(yīng)力作用時(shí)間的延長，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)及NFAT的mRNA表達(dá)量均有所增加;Western blot的檢測結(jié)果顯示，隨著應(yīng)力作用時(shí)間的延長，NFAT

6、的蛋白量也有所增加，這與PCR的檢測結(jié)果相符;可見，CaN-NFAT信號通路參與了周期性張應(yīng)力作用下的大鼠L6成肌細(xì)胞的力學(xué)信號傳導(dǎo)。
　　5.CaN的特異性抑制劑環(huán)孢素(CsA)抑制CaN活性后，成肌細(xì)胞的凋亡率下降，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)和NFAT的mRNA表達(dá)量、NFAT的蛋白量下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.15％的細(xì)胞形變率，10個(gè)循環(huán)/min的周期性張應(yīng)力可以誘導(dǎo)大鼠L6成