類(lèi)大麥屬物種種子貯藏蛋白基因的分子克隆.pdf

1、類(lèi)大麥屬作為小麥族中較為少見(jiàn)的單種屬，在其系統(tǒng)進(jìn)化方面研究較多，而對(duì)其種子貯藏蛋白的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。為了深入了解類(lèi)大麥屬物種貯藏蛋白及其編碼基因，對(duì)類(lèi)大麥屬材料毛節(jié)草(Crithopsisdelileana)的種子貯藏蛋白分別進(jìn)行了分析與鑒定，并且對(duì)部分編碼基因進(jìn)行了克隆和測(cè)序，對(duì)其高分子量谷蛋白亞基(how-molecular-weightgluteninsubunits，HMW-GS)Kx基因進(jìn)行了表達(dá)分析。本研究所獲主要結(jié)果如下：

2、 1.毛節(jié)草種子貯藏蛋白SDS-PAGE和A-PAGE分析 對(duì)2份毛節(jié)草材料種子貯藏蛋白進(jìn)行了SDS-PAGE和A-PAGE分析。利用三種不同的提取方法進(jìn)行SDS-PAGE分析結(jié)果表明，普通提取方法中2份材料在小麥的高分子量谷蛋白區(qū)域均僅有一條帶，電泳遷移率介于普通小麥By8和Dy10亞基之間，推測(cè)為一個(gè)高分子量谷蛋白亞基。在普通小麥的低分子量谷蛋白區(qū)域，出現(xiàn)若干條分辨率不高的蛋白條帶。通過(guò)丙酮沉淀法提取分析，發(fā)現(xiàn)HMW

3、-GS沉淀中只有電泳遷移率介于普通小麥By8和Dy10亞基之間的帶存在，初步確認(rèn)毛節(jié)草中只有一種高分子量谷蛋白亞基。A-PAGE分析表明毛節(jié)草種子醇溶蛋白存在著一些變異類(lèi)型，與普通小麥中國(guó)春相應(yīng)的α、γ和ω醇溶蛋白區(qū)域的電泳遷移率有一定差異。 2、HMW-GS基因克隆與序列分析 利用已知HMW-GS基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)1份毛節(jié)草材料的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增得到兩個(gè)長(zhǎng)度分別為2.1和1.7kb的片段，經(jīng)過(guò)序列分析表明2

4、.1kb片段為Kx亞基編碼基因，而1.7kb片段為Ky亞基(未表達(dá))的編碼基因。Genebank登錄號(hào)分別為AY804128和AY834230。Kx基因全長(zhǎng)編碼區(qū)長(zhǎng)度為2046bp，由其推導(dǎo)的氨基酸序列含682個(gè)氨基酸殘基，具有x型HMW-GS的典型特征，包括21個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽，86個(gè)氨基酸殘基組成的N-端保守區(qū)，533個(gè)氨基酸殘基組成的重復(fù)區(qū)，42個(gè)氨基酸殘基組成的C-端保守區(qū)。N和C-端保守區(qū)內(nèi)分別含3個(gè)和1個(gè)半胱氨酸(C

5、)。重復(fù)區(qū)內(nèi)，含有9個(gè)三肽(GQQ)、56個(gè)六肽(PGQGQQ)、16個(gè)九肽(GYYPTSLQQ)，以及位于重復(fù)區(qū)起始端的十二肽(RYYPSVTSSQQA)和十一肽(SYYPGQASPQR)和重復(fù)區(qū)末端的三肽(GYD)。與其它亞基序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)它與已知高分子量谷蛋白亞基間的主要差異在重復(fù)區(qū)內(nèi)，且集中表現(xiàn)為可重復(fù)短肽類(lèi)型和數(shù)目的增加或減少，以及可重復(fù)單元內(nèi)個(gè)別座位氨基酸的替換和少量部位的缺失。目前，在已知x型高分子量谷蛋白亞基中，Kx的

6、長(zhǎng)度是最短的。Ky亞基的全長(zhǎng)序列長(zhǎng)度為1725bp，由其推導(dǎo)的氨基酸序列同樣具有y型高分子量谷蛋白序列的典型特征。但在核苷酸序列中的1558位置上存在一個(gè)提前終止密碼子，它的存在可能導(dǎo)致Ky編碼基因沉默，從而導(dǎo)致Ky亞基不能得到表達(dá)。 3、LMW-GS基因克隆與序列分析 利用已知LMW-GS基因序列保守區(qū)設(shè)計(jì)一系列引物對(duì)毛節(jié)草基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，成功克隆了4個(gè)LMW-GS基因LMW-GSK1、LMW-GSK2、LMW-

7、GSK3和LMW-GSK4，Genbank序列號(hào)依次為EU283813、EU283814、EU283815和EU283816。其中LMW-GSK3和LMW-GSK4為部分基因序列。同小麥族其它LMW-GS基因進(jìn)行比對(duì)分析后發(fā)現(xiàn)，其5'側(cè)翼序列和氨基酸序列同其它亞基存在較高的一致性，同樣具備LMW-GS的典型特征，同時(shí)也存在著一定的結(jié)構(gòu)差異，這些差異主要來(lái)源于氨基酸殘基的替換以及重復(fù)區(qū)結(jié)構(gòu)單元的缺失或插入。在LMW-GSK1基因序列5'側(cè)

8、翼區(qū)發(fā)現(xiàn)了2個(gè)順式作用元件EM(5'-TGTAAAGT-3')和GLM(5'-GGCGAGTCAT-39、2個(gè)TATAbox、1個(gè)CAATbox和1個(gè)AGGAbox。其推導(dǎo)的氨基酸序列具有一個(gè)由20個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽，一個(gè)15個(gè)氨基酸殘基組成的N端保守區(qū)，一個(gè)由80個(gè)氨基酸組成的重復(fù)區(qū)和一個(gè)由182個(gè)氨基酸殘基組成的C端保守區(qū)。LMW-GSK2和LMW-GSK4編碼區(qū)內(nèi)部均發(fā)現(xiàn)了提前終止密碼子，故推測(cè)它們?yōu)榧倩颉８鶕?jù)所克隆基因的

9、5'側(cè)翼序列和保守區(qū)氨基酸序列同小麥族其他LMW-GS相應(yīng)序列的比對(duì)結(jié)果進(jìn)行分子進(jìn)化分析表明，來(lái)源于K染色體組的LMW-GS可以和小麥A、D染色體組以及黑麥的R和大麥的H染色體組分別聚為關(guān)系相對(duì)較近的類(lèi)群。 4.醇溶蛋白基因分子克隆與序列分析 根據(jù)小麥族已知α和γ醇溶蛋白基因保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，對(duì)毛節(jié)草進(jìn)行PCR擴(kuò)增，成功獲得了3個(gè)α醇溶蛋白基因gli-Ka1、gli-Ka2和gli-Ka3，Genbank登錄號(hào)分別為EU2

10、83817、EU283819和EU283820；2個(gè)γ醇溶蛋白基因gli-Kr1和gli-Kr2，Genbank登錄號(hào)分別為EU283818和EU283821。因在gli-Ka3編碼區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)了1個(gè)提前終止密碼子，故推測(cè)其為假基因。毛節(jié)草的3個(gè)α醇溶蛋白基因與來(lái)源于小麥屬普通小麥、烏拉爾圖小麥和野生二粒小麥，以及具有S和H染色體組的披堿草屬老芒麥、具有D染色體組的粗山羊草、具有W染色體組的澳冰草、具有V染色體組的簇毛麥和具有Ee染色體組的

11、偃麥草屬的相應(yīng)基因進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上有著較高的相似性，同時(shí)也存在著一定的差異，這些差異主要來(lái)源于氨基酸殘基以及重復(fù)區(qū)內(nèi)重復(fù)單元的的替換、缺失和插入。一致性分析表明3個(gè)基因推導(dǎo)的氨基酸序列同其它小麥族相應(yīng)基因氨基酸序列的相似性在57.59％-88.18％范圍內(nèi)變化。2個(gè)γ醇溶蛋白基因與來(lái)源于小麥屬不同品種相應(yīng)基因之間同樣具有較高的相似性，其一致性在62.41％-85.53％范圍內(nèi)變化。保守區(qū)進(jìn)化分析表明，3個(gè)a醇溶蛋白單獨(dú)聚為一類(lèi)，

12、其同時(shí)與具有Ee染色體組的偃麥草屬的α醇溶蛋白基因親緣關(guān)系最近，其次與普通小麥的α醇溶蛋白基因親緣關(guān)系最近；2個(gè)γ醇溶蛋白同樣單獨(dú)聚為一類(lèi)，同時(shí)與來(lái)自于普通小麥品種Bobwhite的γ醇溶蛋白基因親緣關(guān)系最近。 5.HMW-GS基因Kx體外表達(dá)與植物轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建 根據(jù)Kx基因編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)表達(dá)引物，擴(kuò)增其切除信號(hào)肽部分的全長(zhǎng)編碼區(qū)后連接入pET-30a表達(dá)專(zhuān)用載體后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)誘導(dǎo)后Kx基因在細(xì)