豆野螟性信息素結合蛋白MvitPBPs基因的鑒定及功能分析.pdf

1、昆蟲在競爭激烈的自然環(huán)境中不斷繁衍生存，主要受益于其敏銳的嗅覺系統(tǒng)。昆蟲通過發(fā)達的嗅覺系統(tǒng)感知同類或天敵發(fā)出的性信息素或預警信息素，不僅能尋找配偶進行交配和躲避天敵，還能通過感知寄主植物發(fā)出的揮發(fā)性信息素進行寄主識別和產(chǎn)卵定位等。昆蟲嗅覺系統(tǒng)中OBPs起著重要的作用，鱗翅目昆蟲根據(jù)OBPs的特點將其分為兩類:GOBPs和PBPs，PBPs在昆蟲兩性交流中扮演著重要的角色。
　　豆野螟是廣泛危害豆類作物的世界性農(nóng)業(yè)害蟲，主要分布于熱

2、帶及亞熱帶地區(qū)。以幼蟲的鉆蛀行為而聞名，主要危害豆科植物幼嫩的花、豆莢等。課題組前期進行了豆野螟觸角轉(zhuǎn)錄組測序，本研究通過生物信息學技術和分子生物學方法分析利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)擴增得到3個PBPs基因，qRT-PCR分析檢測PBPs基因在不同組織和全身的表達譜，之后體外原核表達純化目的蛋白并利用熒光競爭結合實驗初探其生理功能，結果如下:
　　1、豆野螟MvitPBPs的克隆、序列和進化分析
　　基因克隆得到三令PBPs，并將其命名

3、為MvitPBP1、MvitPBP2、MvitPBP3，分析得出MvitPBPs ORF分別為495，501，519bp。多重序列比對顯示:MvitPBP1與BmorPBP1的序列一致性為47.27％，MvitPBP2與AtraPBP2的序列一致性為48.82％，MvitPBP3與ApolPBP3的序列一致性為43.03％。系統(tǒng)進化分析得出:MvitPBP1與二化螟CsupPBP1聚為一支，MvitPBP2與亞洲玉米螟OnubPBP4聚

4、為一支，MvitPBP3與稻縱卷葉螟CmedPBP2聚為一支。
　　2、熒光定量表達譜分析
　　利用qRT-PCR檢測MvitPBPs在不同組織以及全身的表達水平，結果表明:三個基因主要在嗅覺感器集中分布的觸角中表達，并相對其他組織具有明顯的差異性;其表達水平同時具有性別差異性，MvitPBP1偏雄性表達，MvitPBP2和MvitPBP3偏雌性表達，推測此類基因在豆野螟行為反應中發(fā)揮著不同的功能。
　　3、MvitP

5、BPs原核表達及純化
　　為初步探究MvitPBPs的功能采用原核表達技術體外表達目的蛋白。首先構建原核表達載體pET32a(+)-PBPs，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，IPTG誘導蛋白表達至上清，之后Ni柱親和層析純化目的蛋白，最后腸激酶切除His標簽。SDS-PAGE表明三個蛋白大小都幾乎接近27 kDa，并在圖上呈現(xiàn)出較粗的條帶。
　　4、熒光競爭結合實驗
　　首先測定MvitPBPs與豆野螟4種性信息素

6、的結合特性，結果表明MvitPBPs與4種性信息素都能發(fā)生結合。MvitPBP1與MvitPBP3對E10E12-16: Ald的結合力最強，而MvitPBP2偏好E10-16: Ald，說明這兩種成分可能是豆野螟性信息素的主要組分，MvitPBPs對烯醛類化合物有較高的偏好性。
　　其次檢測MvitPBPs與19種豇豆花揮發(fā)物的結合特性，結果表明MvitPBP1和MvitPBP2能與揮發(fā)物結合，但結合能力較弱，未表現(xiàn)出明顯的差異

7、性。MvitPBP3則能顯著結合Butanoic acid octyl ester（丁酸辛酯），與本課題組前期在研究MvitGOBP2功能時得出MvitGOBP2與丁酸辛酯的結合能力最強相似。
　　綜上所述，豆野螟MvitPBPs與其他鱗翅目昆蟲PBPs表現(xiàn)出的功能類似，在兩性識別中扮演著重要的角色，其中MvitPBP1發(fā)揮的作用極其顯著。MvitPBP3還能與豇豆花揮發(fā)物Butanoic acid octyl ester發(fā)生極特