胃癌的預(yù)后因素分析及mTOR抑制劑RAD001對(duì)胃癌細(xì)胞的作用機(jī)理研究.pdf

1、胃癌是嚴(yán)重危害人民健康的疾病。在全球范圍內(nèi)，胃癌發(fā)病率占所有惡性腫瘤的第四位，死亡率占第二位，每年約有100萬(wàn)的新發(fā)患者。其中，60％的新發(fā)病例在亞洲。胃癌是目前中國(guó)的第三大常見(jiàn)腫瘤，根據(jù)2005年的資料，中國(guó)胃癌發(fā)病率在男性中達(dá)37.1/10萬(wàn)，女性中為17.4/10萬(wàn)。每年新發(fā)胃癌患者達(dá)40萬(wàn)人，死亡人數(shù)達(dá)30萬(wàn)人。手術(shù)是胃癌治療的主要方法，但療效仍徘徊不前，總體5年生存率僅30％左右。 影響胃癌預(yù)后的因素一直是臨床關(guān)注的熱

2、點(diǎn)問(wèn)題，但各家報(bào)道不一。本論文中，我們首次通過(guò)906例大樣本資料，對(duì)胃癌D2術(shù)后患者的預(yù)后因素進(jìn)行分析，探討胃癌臨床病理因素在預(yù)后的意義，以更進(jìn)一步指導(dǎo)臨床治療。 同時(shí)，隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，預(yù)測(cè)胃癌預(yù)后的分子指標(biāo)也已成為腫瘤研究的主要方向。近年來(lái)，表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR(epidermal growth factor receptor)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體VEGF(vascular endothelial growth

3、 factor)等在胃癌預(yù)后方面的意義已給予很大關(guān)注。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白mTOR(mammalian target of rapamycin)信號(hào)通路是當(dāng)前腫瘤治療的新熱點(diǎn)，它的調(diào)控異常與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。在肝癌、乳腺癌、膽管癌中已經(jīng)證明，mTOR的活化形式磷酸化的mTOR(p—mTOR)高表達(dá)與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，是腫瘤治療的新靶點(diǎn)，但p—mTOR與胃癌預(yù)后的關(guān)系鮮見(jiàn)報(bào)道。 本論文中，我們進(jìn)一步研究了胃癌組織中p—mTOR的表達(dá)

4、意義，分析它與胃癌預(yù)后的關(guān)系，并通過(guò)研究mTOR抑制劑依維莫司(RAD001)及聯(lián)合化療對(duì)胃癌細(xì)胞的作用機(jī)理，來(lái)探討mTOR作為胃癌潛在治療靶點(diǎn)的可行性。 第1部分906例胃癌根治術(shù)后預(yù)后多因素分析 目的：影響胃癌預(yù)后的因素很多，文獻(xiàn)報(bào)道差異較大。本研究根據(jù)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目的不同，在新的角度分析胃癌患者的預(yù)后，以加深對(duì)胃痛生物學(xué)行為的認(rèn)識(shí)。 方法：回顧性分析中山大學(xué)腫瘤醫(yī)院1990年1月至2002年12月間接受D2

5、根治術(shù)的胃癌患者906例。根據(jù)淋巴結(jié)檢取個(gè)數(shù)不同分為兩組：第一組，淋巴結(jié)個(gè)數(shù)≤15，729例；第二組，淋巴結(jié)個(gè)數(shù)>15，177例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率分組：N ratio0，0％；N ratio1，1％—9％；N ratio2，10％—25％；N ratio3，>25％. 結(jié)果：兩組的5年生存率分別為49.9％和53.1％。單因素分析表明，兩組資料中腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率均與生存相關(guān)；但多因素分析顯示僅腫瘤浸潤(rùn)深度和

6、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率是影響患者術(shù)后生存的獨(dú)立因素。進(jìn)一步分析顯示，在淋巴結(jié)檢取個(gè)數(shù)不同時(shí)，相同的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率預(yù)后沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論：腫瘤浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率是影響患者D2術(shù)后的獨(dú)立影響因素。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率是一個(gè)比淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)更好的指標(biāo)，在淋巴結(jié)檢取個(gè)數(shù)不足時(shí)，它仍然能夠判斷患者預(yù)后。 第2部分 p—mTOR在181例胃癌中的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 目的：mTOR在多種腫瘤組織中均有表達(dá)，但其與胃癌關(guān)系的研究國(guó)內(nèi)尚無(wú)報(bào)道。

7、本章旨在檢測(cè)中國(guó)人胃癌組織中mTOR的活化形式p—mTOR的表達(dá)，并探討其與胃癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系。 方法：采用免疫組化方法檢測(cè)181例胃癌組織中p—mTOR蛋白的表達(dá)情況，并結(jié)合患者的臨床病理資料分析其與胃癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移相關(guān)性，通過(guò)COX模型多因素分析與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系。 結(jié)果：所檢測(cè)的181例胃癌標(biāo)本中p—mTOR蛋白表達(dá)陽(yáng)性93例，陽(yáng)性表達(dá)率為51.4％，p—mTOR陽(yáng)性表達(dá)與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期密切相關(guān)；而

8、與年齡，性別，腫瘤大小，病理T分期等臨床病理特征無(wú)顯著性相關(guān)(p>0.05)。p—mTOR陽(yáng)性的病人的總生存率與無(wú)病生存率明顯比p—mTOR陰性的病人短(DFS，p=0.006and OS，p=0.011，respectively)。多因素分析中，p—mTOR的表達(dá)與預(yù)后呈相關(guān)趨勢(shì)。 結(jié)論：p—mTOR蛋白在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)，可能成為預(yù)測(cè)胃癌轉(zhuǎn)移的新分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

9、 第3部分 RAD001聯(lián)合化療對(duì)胃癌細(xì)胞的作用及機(jī)理 目的：探索RAD001單藥以及與胃癌常用化療藥物ADM、5-FU、TAXOL、DDP聯(lián)合應(yīng)用是否對(duì)胃癌AGS、BGC823、MKN28細(xì)胞有抑制作用并探討其機(jī)制。 方法：將RAD001單藥以及其分別與化療藥物ADM、5-FU、TAXOL、DDP藥物聯(lián)合作用于人胃癌AGS、BGC823、MKN28細(xì)胞，用MTT法檢測(cè)RAD001單藥及聯(lián)合用藥對(duì)胃癌細(xì)胞的抗增殖作用；用

10、流式細(xì)胞學(xué)(PI染色)檢測(cè)RAD001單藥對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡/周期阻滯的影響；應(yīng)用Western—blot分析P13K/Akt/mTOR直接底物蛋白p70s6k、p—p70s6k以及凋亡/周期相關(guān)蛋白P53、Bcl—2、C—myc、CyclinD1表達(dá)情況。 結(jié)果：RAD001單藥作用于人胃癌AGS、BGC823、MKN28細(xì)胞48小時(shí)后，測(cè)得IC50值分別為23.1μmol/L、21.7μmol/L、13.8μmol/L，提示RA

11、D001單藥對(duì)胃癌細(xì)胞均有抗增殖活性。RAD001單藥作用于AGS、BGC823、MKN28細(xì)胞48小時(shí)，流式細(xì)胞儀顯示胃癌細(xì)胞主要被阻滯在G1期，凋亡率隨藥物濃度而升高。Western—blot分析表明，mTOR底物p70s6k、p—p70s6k明顯下降，周期相關(guān)蛋白C—myc及CyclinD1表達(dá)均下降，凋亡相關(guān)蛋白P53表達(dá)增加、Bcl—2表達(dá)下降，證實(shí)了RAD001是通過(guò)改變下游p70S6K磷酸化水平而起作用，通過(guò)降低C—myc

12、及CyclinD1的表達(dá)而使細(xì)胞通過(guò)G1-S期的檢查點(diǎn)下降，將細(xì)胞阻滯在G1期，并可能通過(guò)抑制凋亡抑制蛋白Bcl—2，促進(jìn)促凋亡蛋白P53表達(dá)而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡。RAD001單藥分別與化療藥物ADM、5-FU、TAXOL、DDP以固定濃度混合共同作用于AGS、BGC823、MKN28細(xì)胞，結(jié)果采用金正均法顯示：RAD+ADM聯(lián)合呈現(xiàn)協(xié)同作用，RAD+5FU、RAD+DDP聯(lián)合呈現(xiàn)拮抗作用，RAD+Taxol聯(lián)合呈現(xiàn)單純相加作用。流式細(xì)

13、胞儀顯示凋亡率較各單藥組升高。Western—blot分析表明，mTOR底物p70s6k、p—p70s6k較各單藥組下降，與單獨(dú)用藥相比，凋亡相關(guān)蛋白P53表達(dá)增加、Bcl—2表達(dá)下降，這表明，RAD001作用于AGS、BGC823、MKN28細(xì)胞48小時(shí)后，與對(duì)照組蛋白表達(dá)情況相比，p70s6k、p—p70s6k在實(shí)驗(yàn)組表達(dá)明顯受到抑制，提示RAD+ADM的協(xié)同作用是通過(guò)阻斷靶點(diǎn)mTOR，使P13K/AKT/mTOR信號(hào)路的下游受到抑

14、制，并可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。 結(jié)論：RAD001單藥及化療藥物ADM、5-FU、TAXOL、DDP藥物對(duì)人胃癌AGS、BGC823、MKN28細(xì)胞均有良好抗增殖作用；RAD+ADM聯(lián)合呈現(xiàn)協(xié)同作用，RAD+5FU、RAD+DDP聯(lián)合呈現(xiàn)拮抗作用，RAD+Taxol聯(lián)合呈現(xiàn)單純相加作用；這些作用是通過(guò)改變下游p70S6K磷酸化水平，使細(xì)胞停滯在G1期，并可能通過(guò)抑制凋亡抑制蛋白Bcl—2，促進(jìn)促凋亡蛋白P53表