篩選鑒定雙重耐藥幽門螺桿菌和HBD-2融合蛋白的體外抗菌作用.pdf

1、全文分為三部分： 第一部分：幽門螺桿菌三聯(lián)根除療法影晌因素的logistic回歸分析 幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,Hp)是淺表性胃炎、消化性潰瘍的致病因子,與胃癌、胃黏膜相關(guān)性淋巴組織淋巴瘤密切相關(guān),世界上約有一半以上的人感染Hp.幽門螺桿菌根除是治療消化性潰瘍和防止復(fù)發(fā)的重要手段.國內(nèi)外很多研究提示,PPI聯(lián)合克拉霉素、阿莫西林/甲硝唑是Hp根除的有效治療方案.但由于幽門螺桿菌耐藥性等問題,嚴(yán)重的

2、影響了該三聯(lián)療法的療效.另外,研究表明,Hp耐藥問題及患者醫(yī)囑順從性不能完全解釋Hp根治失敗的原因.目前缺乏Hp根除率影響因素綜合評價的研究. 目的:是評估在浙江地區(qū),以質(zhì)子泵抑制劑(PPI)為基礎(chǔ)聯(lián)用克拉霉素、阿莫西林/甲硝唑的三聯(lián)療法根治幽門螺桿菌的療效,探討幽門螺桿菌的耐藥性、患者的性別、年齡、煙酒史、疾病類型和組織學(xué)改變對幽門螺桿菌根除率的影響.通過這一研究,也為進(jìn)一步研究多藥耐藥幽門螺桿菌提供了物質(zhì)基礎(chǔ).

3、材料和方法:患者行胃鏡檢查,符合研究入選標(biāo)準(zhǔn)的患者共取4塊組織標(biāo)本,一塊胃竇組織做快速尿素酶試驗,一塊胃竇組織行幽門螺桿菌培養(yǎng)和藥敏試驗,2塊胃竇組織行組織學(xué)檢查.患者幽門螺桿菌培養(yǎng)陽性或快速尿素酶、組織學(xué)檢查陽性被認(rèn)為是幽門螺桿菌感染.所有患者接受7天幽門螺桿菌根除治療:達(dá)克普隆(30mg)、克拉霉素(500mg)、阿莫西林(1g)或甲硝唑(0.5g),每天2次,口服.治療結(jié)束后4-6周,采用C<'14>-尿素呼氣試驗評估幽門螺桿菌根

4、除情況.同時收集患者的一般情況.所有組織標(biāo)本由一高年資的病理科醫(yī)生評估.幽門螺桿菌藥敏試驗采用紙片法和二倍平皿稀釋法.運用SAS軟件,分析研究對象的各類數(shù)據(jù),采用x<'2>檢驗和多因素非條件logistic回歸分析的方法,P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異. 結(jié)果與結(jié)論:78個幽門螺桿菌感染的患者中,42個男性,36個女性,平均年齡46歲,27個患者有活動性十二指腸潰瘍(占34.6﹪),51個患者是非潰瘍性消化不良(NUD).34個

5、患者有抽煙史,6個患者有較嚴(yán)重的喝酒史.幽門螺桿菌根除率為61/78(78.2﹪).5個患者出現(xiàn)輕度治療副反應(yīng)(輕度腹瀉=2,上腹不適=3).在78株幽門螺桿菌菌株中,對克拉霉素原發(fā)性耐藥率為14.1﹪,甲硝唑耐藥率為69.2﹪,阿莫西林耐藥率為1.3﹪,其中對克拉霉素耐藥的菌株同時存在甲硝唑耐藥,共11株,未發(fā)現(xiàn)同時對3種抗生素耐藥的菌株.患者性別、克拉霉素耐藥、十二指腸潰瘍病變,這三變量是Hp根除失敗的獨立相關(guān)因素(P<0.05).

6、在本研究中,患者的年齡,煙酒史,胃竇部組織學(xué)改變與療效無明顯相關(guān)性(P>0.05). 第二部分:多藥耐藥幽門螺桿菌篩選及鑒定 如何治療幽門螺桿菌反復(fù)根除失敗的患者是臨床上一棘手的問題.目前,關(guān)于多藥耐藥幽門螺桿菌的耐藥機(jī)制、根除等研究罕見報道.有必要從臨床篩選、鑒定多藥耐藥菌株,以便進(jìn)一步研究其耐藥機(jī)制,尋求新的根除手段.通過我們前面的研究,我們分析了幽門螺桿菌根除治療的影響因素,更重要的是,我們初步篩選了一些多藥耐藥

7、的幽門螺桿菌菌株.通過藥敏試驗,雖然沒能發(fā)現(xiàn)存在克拉霉素、甲硝唑、阿莫西林三個藥物同時耐藥的菌株,但我們篩選到了一些克拉霉素、甲硝唑同時耐藥的菌株.從中,我們篩選了5株高M(jìn)IC的幽門螺桿菌菌株,通過病例的隨訪,這些菌株的感染者三聯(lián)治療失敗后換用四聯(lián)療法,最后依然沒有根除幽門螺桿菌.通過臨床的治療效果和體外藥敏實驗,我們從臨床初步判斷其為多藥耐藥幽門螺桿菌.本實驗?zāi)康?就是通過菌株培養(yǎng),分析甲硝唑、克拉霉素耐藥的相關(guān)基因rdxA、23Sr

8、RNA,從實驗室角度進(jìn)一步篩選、鑒定其是否是多藥耐藥幽門螺桿菌. 材料和方法:按傳統(tǒng)的酚一氯仿抽體法提取了幽門螺桿菌基因組DNA,根據(jù)文獻(xiàn)和Hp26695株基因序列,分別設(shè)計和合成rdxA、23SrRNA序列的特異性引物,由上海博亞生物技術(shù)有限公司(BioAsia)合成,1.5﹪的瓊脂糖凝膠電泳檢查擴(kuò)增產(chǎn)物.將10ul 23SrRNA基因PCR產(chǎn)物行RFLP分析,分別用BsaI、BbsI兩種限制性內(nèi)切酶酶切.前者于50℃孵育24

9、 hr,后者于37℃孵育24 hr.同時將rdxA基因PCR產(chǎn)物行T-A克隆,委托上海申能搏彩生物科技有限公司,采用雙脫氧鏈末端終止法在測序儀上測定含正確大小插入片段的核苷酸序列. 結(jié)果:5株臨床菌株我們命名為Hp20061、Hp20062、Hp20063、Hp20064、Hp20065、rdxA基因測序結(jié)果,Hp20063菌株于193位點額外插入了了一堿基A,Hp20065菌株于549位點額外插入了一堿基A,導(dǎo)致菌株的rdx

10、A基因核苷酸序列出現(xiàn)移碼突變,從而導(dǎo)致翻譯的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的改變.而另3個多藥耐藥菌株由于出現(xiàn)多位點堿基突變,也導(dǎo)致相應(yīng)的氨基酸改變.23SrRNA基因RFLP分析,5株多藥耐藥菌株的PCR擴(kuò)增物可被BsaI酶切成兩個片段.5株擴(kuò)增物均未能被BbsI酶切.提示5株多藥耐藥菌株在23S rRNA基因功能區(qū)V第2144位點有A→G突變.所有菌株均不存在2143位點A→G突變. 結(jié)論:通過對5株幽門螺桿菌菌株的rdxA基因、23S

11、rRNA基因的分析,我們認(rèn)為菌株Hp20063、Hp20065是多藥耐藥幽門螺桿菌,而Hp20061、Hp20062、Hp20064菌株臨床為多藥耐藥菌株,但其分子生物學(xué)特性有待更進(jìn)一步的實驗室鑒定. 第三部分 HBD-2融合蛋白對多藥耐藥幽門螺桿菌的體外抗菌作用 機(jī)體對于幽門螺桿菌感染的自身反應(yīng)主要是通過中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞引起的一系列免疫反應(yīng).研究表明,幽門螺桿菌感染會引起機(jī)體一些抗菌肽表達(dá)水平升高.抗菌肽是廣泛

12、存在于動、植物體內(nèi),具有一定抗菌譜的小分子肽.在脯乳動物中發(fā)現(xiàn)的抗菌肽主要是防御素(defensin),防御素可分為α和β兩類,β-防御素家族在許多上皮組織包括消化道上皮中有更廣泛的表達(dá).在人類中,已發(fā)現(xiàn)4種β-防御素(HBD1～4).防御素具有廣譜的抗菌活性,HBD-1對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、真菌、螺旋體、分支桿菌及有包膜病毒均具有殺滅作用,HBD-2對革蘭陰性菌、革蘭陽性菌、酵母菌具有較強(qiáng)的殺菌作用,其對革蘭陰性菌殺菌作用更為顯著

13、.已有研究表明,在體外試驗中,HBD-2對于幽門螺桿菌具有較強(qiáng)的殺傷作用,但是對于多藥耐藥幽門螺桿菌的作用如何,尚未有文獻(xiàn)報道.另外,大量研究表明,抗菌藥物的抗菌作用體內(nèi)試驗和體外試驗往往會存在很大差別,因此,有必要開展HBD-2抗幽門螺桿菌的體內(nèi)試驗.但是,由于存在一些客觀原因1)目前HBD-2蛋白質(zhì)來源不多,購買比較昂貴2)胃酸對蛋白質(zhì)的降解作用,很少有關(guān)于HBD-2相關(guān)的胃腸道體內(nèi)試驗的研究.因此,我們覺得有必要基因重組表達(dá)HBD

14、-2蛋白,并研究重組蛋白對多藥耐藥幽門螺桿菌的抗菌活性. 材料和方法:LB固體培養(yǎng)基上分離劃線,在含氨芐青霉素的新鮮LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),超聲破碎儀破碎,獲得重組HBD-2融合蛋白.再將樣品過NTA層析柱,收集目的蛋白反復(fù)透析,用SDS-PAGE分析確定目的蛋白的分布情況,純化復(fù)性后的蛋白質(zhì)濃縮保存.用二倍平皿稀釋法,分別選擇5株多藥耐藥幽門螺桿菌和5株MTZ、ClA敏感菌株,檢測其MIC.用t-test檢驗2