AML1b和AML1-ETO對(duì)pig7基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)及pig7基因?qū)Π籽〖?xì)胞增殖活性影響的研究.pdf

1、研究目的：觀察AML1b基因及其融合基因AML1—ETO對(duì)pig7基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響，探討AML1與pig7的相互作用在白血病發(fā)生中的機(jī)制，并通過(guò)功能性實(shí)驗(yàn)闡釋pig7對(duì)白血病細(xì)胞增殖活性的影響。 研究方法：AML1b和AML1—ETO表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染及共轉(zhuǎn)染CV—1和293細(xì)胞，用Realtime-PCR方法檢測(cè)上述基因?qū)煞N細(xì)胞內(nèi)源性pig7基因mRNA表達(dá)水平的影響；構(gòu)建含AML1b結(jié)合位點(diǎn)的pig7基因增強(qiáng)子序列以

2、及相對(duì)應(yīng)的突變位點(diǎn)的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒；將表達(dá)載體/突變載體與AML1b或(和)AML1—ETO基因瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染CV—1細(xì)胞，分析AML1b、AML1—ETO對(duì)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。構(gòu)建含有pig7開(kāi)放讀碼框(ORF)的慢病毒表達(dá)載體pCDH-Pig7及含有pig7反義片段的慢病毒表達(dá)載體pCDH—anti-Pig7，并分別導(dǎo)入白血病細(xì)胞，表達(dá)pig7基因及干擾RNA片段，研究該基因的生物學(xué)功能。 結(jié)果：轉(zhuǎn)染AML1b的兩種細(xì)

3、胞系，其內(nèi)源性pig7基因mRNA表達(dá)水平均明顯上調(diào)；含有轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1511至1503的TTTGTGGAT序列的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒的表達(dá)活性與共轉(zhuǎn)染的AML1b質(zhì)粒劑量呈明顯的“劑量—效應(yīng)”關(guān)系，熒光素酶表達(dá)活性上調(diào)最高達(dá)3倍(P<0.05)；而AML1—ETO在不同劑量條件下對(duì)熒光素酶表達(dá)活性調(diào)節(jié)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。在一定劑量范圍內(nèi)，共轉(zhuǎn)染的AML1—ETO可拮抗AML1b的調(diào)節(jié)作用。應(yīng)用pCDH慢病毒系統(tǒng)成功構(gòu)建

4、并包裝出pCDH-Pig7慢病毒及pCDH—anti-Pig7慢病毒，體外感染白血病細(xì)胞系Kasumi—1和NB4后，在細(xì)胞高表達(dá)pig7蛋白的同時(shí)，Kasumi—1細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡和分化趨勢(shì)，而NB4細(xì)胞增殖率并無(wú)明顯變化，但聯(lián)合應(yīng)用藥物全反式維甲酸(ATRA)作用于NB4細(xì)胞后，也表達(dá)出明顯的促凋亡和分化作用(P<0.05)；當(dāng)細(xì)胞內(nèi)源性pig7表達(dá)受到抑制的同時(shí)，Kasumi—1及NB4細(xì)胞均對(duì)藥物表現(xiàn)出不同程度的耐受性(P<0