MG-132對(duì)心肌缺血再灌注大鼠心臟結(jié)構(gòu)功能及HSP70-CHIP的影響.pdf

1、1.目的和意義：
　　 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（Ubiquitin Proteasome System，UPS）是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)選擇性降解的主要途徑，參與了細(xì)胞內(nèi)80％以上的蛋白質(zhì)更新。熱休克蛋白70（HeatShock Protein70，HSP70）為細(xì)胞內(nèi)源性保護(hù)蛋白，是熱休克蛋白系統(tǒng)的重要成員，在防止應(yīng)激引起的細(xì)胞損害和修復(fù)損傷方面起著重要作用。近期發(fā)現(xiàn)，熱休克蛋白70羧基端相互作用蛋白（Carboxyl terminus o

2、f the Hsc70-interacting protein，CHIP）即是熱休克蛋白的輔助分子伴侶又是一個(gè)E3泛素連接酶，作為熱休克蛋白與泛素-蛋白酶體系統(tǒng)之間的聯(lián)接蛋白，在應(yīng)激條件下發(fā)揮關(guān)鍵的雙分子開關(guān)作用。本研究以大鼠心肌缺血再灌注模型作為研究對(duì)象，分別觀察再灌注前、再灌注2h、24h、7d的CHIP及HSP70的表達(dá)及7d的心功能情況，然后通過使用蛋白酶體抑制劑MG-132進(jìn)行干預(yù)，在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)觀察上述指標(biāo)變化，旨在探討CHI

3、P及HSP70對(duì)缺血再灌注心肌的影響。
　　 2.研究方法：
　　 結(jié)扎Sprague-Dawley大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支（Left Anterior Descending，LAD）形成心肌缺血，30min后松開LAD達(dá)到再灌注，制作心肌缺血/再灌注（I/R）模型，54只大鼠分為以下三大組7個(gè)亞組：
　　 （1）缺血/再灌注對(duì)照（I/R）組：結(jié)扎大鼠LAD30min后再灌注，于再灌注前5min股靜脈注入3ml生理鹽

4、水，并根據(jù)取材時(shí)間點(diǎn)的不同，將該組分為I/R2h、I/R24h、I/R7d三個(gè)亞組，每個(gè)亞組8只大鼠。
　　 （2）缺血/再灌注+MG-132處理（I/R+T）組：缺血和再灌注時(shí)間以及分組情況完全同I/R組，于再灌注前5min股靜脈注入0.75mg/kg（溶于3ml生理鹽水中）的MG-132，每個(gè)亞組8只大鼠。
　　 （3）假手術(shù)（Sham）組：手術(shù)過程同I/R組，但只穿線不結(jié)扎LAD，穿線后25min股靜脈注入3ml生

5、理鹽水，以穿線后開始觀察2h；假手術(shù)組6只大鼠。
　　 連續(xù)監(jiān)測(cè)每只大鼠手術(shù)前、結(jié)扎LAD即刻及再灌注2h的心電圖，進(jìn)行心律失常評(píng)分；計(jì)算各組存活率；相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)血流動(dòng)力學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)，酶免法檢測(cè)血清腦鈉肽水平；電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)變化；熒光定量PCR法檢測(cè)CHIP、HSP70 mRNA表達(dá)，免疫組化法及蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)CHIP、HSP70的蛋白質(zhì)水平。
　　 3.結(jié)果：
　　 （1）大鼠生存及死亡分析：8只大鼠于

6、實(shí)驗(yàn)中死亡。Sham組大鼠均全部存活；I/R組存活19只，存活率為79％：I/R+T組存活21只，存活率為88％，I/R+T組較I/R組大鼠生存率顯著增加（p<0.05），心律失常是死亡的主要原因。與I/R組相比，IR+T組首次發(fā)生心律失常的時(shí)間顯著延遲（分別為51±22 s vs129±43 s，p<0.01），室速、室顫的發(fā)生率降低（室速67％vs40％，室顫19％vs6％），持續(xù)時(shí)間縮短（室速27.1±10.2 s vs15.8±

7、8.1 s，p<0.05：室顫10.8±5.5 s vs7.1±2.8 s，p<0.05），心律失常得分明顯下降（分別為3.6±0.7 vs2.4±0.4，p<0.05）。
　　 （2）HE染色：光鏡下，假手術(shù)組的心臟三層結(jié)構(gòu)清晰，心肌纖維排列整齊。I/R24h亞組心肌肌漿紅染，梗死周圍炎癥反應(yīng)明顯，與其相比，I/R+T24h亞組心肌肌漿紅染、炎癥反應(yīng)減輕。I/R7d亞組見大片心肌組織壞死溶解，被增生的肉芽組織所替代，其間可見散

8、在分布呈島狀或細(xì)帶狀的存活心肌組織，橫紋消失，肌絲斷裂溶解，核固縮或溶解。I/R+T7d亞組壞死心肌明顯減少。
　　 （3）透射電鏡：I/R24h組電鏡下可見肌絲排列紊亂、溶解或消失，線粒體腫脹，局部肌絲與閏盤分離，肌纖維明暗帶模糊。I/R7d組心肌細(xì)胞線粒體普遍損傷嚴(yán)重，嵴不清楚，細(xì)胞核濃縮，多切跡凹陷，染色質(zhì)分布及排列異常。相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的I/R+T組較I/R組超微結(jié)構(gòu)損傷均有改善。
　　 （4）血流動(dòng)力學(xué)變化：與Sha

9、m組比較，I/R7d組大鼠心率增快，左室舒張末壓升高，左室收縮壓及左室最大收縮速率降低（p<0.05）。I/R7d組和I/R+T7d組左室收縮壓分別為108+11mmHg和126±10mmHg，左室最大收縮速率分別為4660±480 mmHg/s和5355±554 mmHg/s，與I/R組相比，I/R+T組的上述指標(biāo)均有明顯升高（p<0.05）；I/R7d組和UR+T7d組左室舒張術(shù)壓分別為19+4mmHg和15±3mmHg，I/R+T

10、組有減低趨勢(shì)。
　　 （5）血清腦鈉肽（BNP）水平：與I/R24h組相比，I/R+T24h組的BNP水平有下降趨勢(shì)（分別為528±116 pg/ml VS452±88 pg/ml，p=0.07）；I/R+T7d組的BNP水平較I/R7d組下降41％（分別為1486±142 pg/ml vs883±104 pg/ml，p<0.01）。
　　 （6）心肌HSP70及CHIP mRNA水平：
　　 心肌HSP70 m

11、RNA水平：與Sham組相比，I/R組和FR+T組各亞組的HSP70mRNA表達(dá)顯著升高（p<0.01）；I/R+T2h組較I/R2h組升高56％（分別為0.87±0.10 VS0.50±0.06，p<0.01）；I/R+T24h組、7d組比I/R相應(yīng)亞組分別增加45％和48％，P值均小于0.01（I/R24h組及I/R+T24h組分別為0.33±0.04 vs
　　 0.57±0.07；FR7d組及I/R+T7d組分別為0.1

12、9±0.03 vs0.47±0.06）；FR組與I/R+T組組內(nèi)比較，均以2h亞組表達(dá)最多。
　　 心肌CHIP mRNA水平：I/R2h組CHIP mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.57±0.07，I/R+T2h組是其2.02倍（1.15±0.12），兩組比較差異有顯著性（p<0.01）；I/R24h組和FR+T24h組CHIP mRNA水平分別為0.44±0.06和0.81±0.09，二者相比差異有顯著性（p<0.01）；與I/R7d

13、組相比，I/R+T7d組升高19％（分別為0.42±0.04 vs0.50±0.07）；I/R與I/R+T各組內(nèi)比較，均以2h組表達(dá)最多。
　　 HSP70和CHIP mRNA相關(guān)性分析：以各只大鼠心肌組織的HSP70 mRNA表達(dá)量為因變量，CHIP mRNA表達(dá)量為自變量，采用直線相關(guān)分析法進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：各組大鼠心肌組織中的HSP70 mRNA表達(dá)量與心肌組織中的CHIPmRNA表達(dá)量呈顯著正相關(guān)（p<0.01）。所得

14、的直線方程為Y=0.98X.0.12（R2=0.94）。
　　 （7）免疫組化檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)：
　　 I/R各組的HSP70積分光密度值與Sham組（96±10）相比有顯著增加（p<0.01），其中I/R2h組最高，為336+26，F(xiàn)R24h和7d組分別為266±14和228±13；I/R+T2h、24h和7d組的HSP70分別為482±37、479±42和393±24，較I/R相應(yīng)組增高44％、54％和72％，差異均有

15、顯著性（p<0.01）。
　　 Sham組CHIP積分光密度值為190±12，與其相比，I/R2h組CHIP水平（278±13）明顯升高（p<0.05），而I/R24h和7d組較Sham組有所升高，但差異不顯著（p<0.05）。MG-132處理增加了CHIP表達(dá)，I/R+T2h、24h和7d組分別較I/R組升高30％、32％、19％（p<0.05）。
　　 （8）western-blot檢測(cè)HSP70及CHIP蛋白質(zhì)水平

16、：
　　 以β-actin作為內(nèi)對(duì)照，HSP70蛋白Sham組為0.21±0.02，I/R各組HSP70表達(dá)量均顯著高于Sham組，其中I/R2h組表達(dá)量為0.79±0.08，是Sham組的3.76倍；I/R24h組和I/R7d組表達(dá)量分別是Sham組的2.76倍和2.38倍（p<0.01）。MG-132顯著刺激HSP70的表達(dá)，I/R+T2h組、24h組和7d組的HSP70分別為1.28±0.16、0.88±0.12和0.99

17、±0.17，較I/R相應(yīng)各組升高了62％、52％、98％，差異均有顯著性（p<0.01）。
　　 4.結(jié)論：
　　 （1）蛋白酶體抑制劑MG-132能夠減少大鼠缺血再灌注早期心肌炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、改善其超微結(jié)構(gòu)變化，改善心功能，抑制腦鈉肽水平，顯著減少心肌缺血再灌注后室性心律失常的發(fā)生，降低死亡率，具有心肌保護(hù)作用。
　　 （2）蛋白酶體抑制劑MG-132通過誘導(dǎo)缺血再灌注大鼠心肌組織CHIP表達(dá)，上調(diào)心肌HSP70