幽門螺桿菌感染以及高鹽和多酚的刺激對增殖相關蛋白CIP2A表達的影響.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是革蘭氏陰性、螺桿狀的微需氧菌,可定植于胃粘膜上皮細胞,是慢性胃炎、消化道潰瘍、胃粘膜相關淋巴組織(MALT)淋巴瘤及胃癌發(fā)生的危險因素,1994年世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(IARC)已將其列為Ⅰ類致癌因子。幽門螺桿菌的某些菌株包含有一段由27-33個基因編碼的35-40 kb cag致病島(PAI)。cagA基因是cag致病島的重要組成部分之一,它編碼了幽門螺桿

2、菌的重要毒力蛋白CagA(120-140kDa)。CagA蛋白含有一段能夠發(fā)生酪氨酸磷酸化的EPIYA基序,幽門螺桿菌黏附到胃粘膜上皮細胞以后,可通過四型分泌系統(tǒng)將毒力因子CagA蛋白注入上皮細胞。在cagA-positive幽門螺桿菌菌株的感染中,細菌源性的致癌因子CagA蛋白廣泛的參與到細菌感染導致的胃組織損傷以及致癌的過程之中,但涉及的分子機制尚未完全明了。
　　 腫瘤發(fā)生的標志之一是細胞進入無序增殖狀態(tài),伴有一些參與到調(diào)

3、節(jié)細胞周期進程、細胞的增殖、分化以及凋亡、衰老的重要細胞因子的表達紊亂。新鑒定的重要原癌蛋白CIP2A能通過抑制PP2A的活性來穩(wěn)定MYC蛋白的表達并且促進腫瘤的形成。并且,在胃癌組織中CIP2A的表達量高于相對應的正常胃組織,其功能與胃癌細胞的增殖能力密切相關。而作為Btk酪氨酸激酶家族成員之一的BMX/Etk激酶的功能也涉及到對細胞增殖能力的促進以及對環(huán)境刺激的適應性調(diào)控。因此,闡明幽門螺桿菌感染和CIP2A之間的效應關系可以幫助我

4、們更深入的理解幽門螺桿菌感染的致癌機理以及CIP2A在胃癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用。
　　 胃癌的發(fā)生發(fā)展除了受到幽門螺桿菌的菌株特點影響外,還受到宿主的遺傳易感性和環(huán)境因素的影響,與胃癌高發(fā)風險相關的環(huán)境因素之一就是高鹽飲食。在人群的流行病學研究和動物模型中高鹽飲食和胃癌的發(fā)病率之間的關系已經(jīng)被充分證實。但是高鹽飲食是通過何種機制增強了人群中胃癌的發(fā)病率尚未完全明了。因此,探討高鹽對細菌誘導的CIP2A表達增強效應可以幫助我們更深

5、入的理解高鹽飲食和幽門螺桿菌感染在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮協(xié)同作用的分子機制。而表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)作為從天然植物綠茶中提取出來的單體成分(多酚類),其抑制腫瘤細胞增殖的能力已經(jīng)通過動物實驗模型、流行病學調(diào)查、以及病例對照研究等得到充分的證實。但EGCG抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制尚未完全闡明。因此,研究EGCG對細胞中CIP2A表達水平的影響可以為理解EGCG抑制腫瘤細胞增殖能力的分子機制提供更多的幫助。
　　 胃

6、癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一,中國是胃癌的高發(fā)國家,其致死率位居全球腫瘤相關致死率第二位。由于缺乏可靠的早期診斷標志,胃癌的預后情況并不樂觀。促進胃癌發(fā)生發(fā)展的因素涉及生物致癌因素(幽門螺桿菌)和化學致癌因素(高鹽和亞硝酸鹽)的刺激；抑制胃癌發(fā)生發(fā)展的因素涉及多酚類(綠茶)和維生素類的攝入。腫瘤的分子診斷與預測,已成為近年來腫瘤研究的熱點領域。而與胃癌發(fā)生發(fā)展相關的保護性和致癌性的因素是否都存在一個相同的作用靶點分子,至今尚未完全

7、闡明。本研究的內(nèi)容主要涉及幽門螺桿菌的感染以及環(huán)境因素中的高鹽和EGCG的刺激對腫瘤細胞的增殖相關蛋白CIP2A表達的影響,旨在闡明CIP2A分子作為與胃癌發(fā)生發(fā)展相關的保護性和致癌性因素存在的共同作用靶點的依據(jù)。該課題主要研究內(nèi)容及實驗結(jié)果如下:
　　 一、幽門螺桿菌的感染能夠促進CIP2A的表達上調(diào)
　　 幽門螺桿菌感染胃粘膜上皮細胞后,能激活一系列的信號途徑,包括MEK/ERK途徑,β-catenin途徑,Src

8、kinase途徑,NF-κB途徑,以及p38 MAPkinase途徑。并且能夠影響細胞內(nèi)許多致癌因子的表達變化,例如影響MYC蛋白的穩(wěn)定,影響β-catenin的核轉(zhuǎn)移,以及影響細胞周期相關蛋白Cyclin D1的表達。但是迄今為止,幽門螺桿菌的感染對原癌蛋白CIP2A表達的影響尚未明了。本研究通過實施幽門螺桿菌感染細胞以及CagA的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞的實驗,以及應用了激酶抑制劑來驗證哪幾條信號通路參與了CagA誘導的CIP2A表達上調(diào)效

9、應,此外實施了針對CIP2A的RNA干擾實驗,以及干擾后幽門螺桿菌再次感染細胞的實驗。通過western blot檢測首次在細胞系中闡明了幽門螺桿菌的感染以及細菌源性的癌蛋白CagA誘導細胞的癌蛋白CIP2A表達上調(diào)的效應機理。CagA蛋白進入細胞后,激活了Src和MEK/ERK信號途徑,并最終導致CIP2A的表達上調(diào)。本研究結(jié)果為深入理解幽門螺桿菌感染誘發(fā)胃癌的分子機制提供了有力的佐證。
　　 二、高鹽刺激能夠增強幽門螺桿菌感

10、染所誘導的CIP2A表達上調(diào)
　　 本論文中第一部分的實驗已經(jīng)闡明了幽門螺桿菌的感染以及細菌源性的癌蛋白CagA誘導CIP2A表達上調(diào)的效應機理,為深入的理解幽門螺桿菌感染導致胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機制提供了線索；同時,環(huán)境中高鹽因素的刺激也是胃癌高發(fā)的危險因素之一,并且高鹽飲食可能作為幽門螺桿菌感染導致胃癌的協(xié)同刺激因素存在。為了闡明高鹽因素刺激幽門螺桿菌后對細菌的包括CagA在內(nèi)的毒力因子表達的影響,以及高鹽刺激后的幽門螺桿菌感

11、染細胞是否比普通幽門螺桿菌感染細胞具有更強的誘導CIP2A表達上調(diào)的能力,我們設計了培養(yǎng)基中不同鹽濃度刺激幽門螺桿菌后檢測相關毒力基因表達量的實驗以及高鹽刺激后的幽門螺桿菌和普通的幽門螺桿菌分別感染細胞后對CIP2A表達量影響的western blot檢測。實驗結(jié)果表明環(huán)境中高鹽因素的刺激能夠誘導幽門螺桿菌毒力相關基因(cagA、vacA、tlpB、tip-alpha)的表達水平上調(diào),經(jīng)高鹽刺激后毒力增強的細菌感染真核細胞后,可以增強細

12、菌感染細胞所誘導的癌蛋白CIP2A表達上調(diào)效應,進而促進胃癌的發(fā)生發(fā)展；此外,通過對CIP2A分子的檢測分析有助于理解高鹽飲食和幽門螺桿菌感染在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮協(xié)同作用的分子機制。
　　 三、EGCG能通過抑制BMX和CIP2A來抑制腫瘤細胞的增殖
　　 EGCG抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制涉及到眾多因子,包括:抑制癌蛋白Myc的表達、抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的表達以及對P53和BCL-2等凋亡相關蛋白的影響等

13、。而BMX/Etk酪氨酸激酶和CIP2A屬于一類與腫瘤細胞增殖能力相關的重要細胞因子。而迄今為止,具有抗腫瘤活性的綠茶提取物EGCG和BMX激酶以及癌蛋白CIP2A之間的關系尚未實施探討。因此,研究EGCG與BMX激酶以及癌蛋白CIP2A之間的關系,以及BMX和CIP2A之間的相互調(diào)節(jié)關系可以幫助我們更深入的理解EGCG在抑制腫瘤細胞增殖過程中發(fā)揮作用所涉及的分子機制?；谝陨夏康?設計了相關實驗來驗證EGCG作用細胞后對BMX和CIP

14、2A蛋白表達量的影響；應用了真核表達質(zhì)粒以及siRNA干擾技術來觀察BMX和CIP2A之間的相互調(diào)控關系；此外,還進行了克隆形成實驗來觀察CIP2A在EGCG誘導的抑制腫瘤細胞增殖中的作用。實驗結(jié)果證實了EGCG作用于細胞后可以導致細胞中CIP2A和BMX的表達水平降低,發(fā)現(xiàn)了BMX可以正向調(diào)控CIP2A的表達,并驗證了EGCG發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖能力所可能涉及的分子機制。這就為更充分的理解EGCG抑制腫瘤細胞增殖能力的分子機理提供了更