DNA雜交信號(hào)的介質(zhì)調(diào)控和酶法放大研究.pdf

1、序列決定了DNA分子特性，DNA序列的變化導(dǎo)致人類個(gè)體間的差異。約90％的DNA序列變化歸因于單核苷酸多態(tài)性(SNP)，即基因組水平上單個(gè)位點(diǎn)堿基的改變。SNP與人類進(jìn)化、遺傳性疾病、個(gè)體藥物敏感性等困擾人類從而引起普遍關(guān)注的問(wèn)題緊密相關(guān)，對(duì)SNP的研究將會(huì)對(duì)人類進(jìn)化過(guò)程、基因定位、藥物開(kāi)發(fā)、疾病診療等方面產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。其中，建立適用于遺傳性疾病、腫瘤的早期診斷以及診療過(guò)程的簡(jiǎn)便快速的SNP檢測(cè)方法在臨床診療中具有十分重要的意義。

2、>　　 本論文研究目標(biāo)就是采用普通的分析儀器，建立簡(jiǎn)便快速識(shí)別具有不匹配堿基的核苷酸鏈的方法，使之能應(yīng)用于普通診療機(jī)構(gòu)。
　　 一、染料放大DNA雜交信號(hào)的研究
　　 插入式熒光染料與DNA雙鏈結(jié)合后產(chǎn)生熒光，可以放大DNA的雜交信號(hào)，但需要采用熒光光度計(jì)檢測(cè)信號(hào)?；ㄇ嗳玖显诳梢?jiàn)光區(qū)具有強(qiáng)吸收，如果能與DNA雙鏈特異性結(jié)合，就可以將DNA雜交信號(hào)轉(zhuǎn)化為可見(jiàn)光區(qū)的光吸收信號(hào)，用普通分光光度計(jì)就可進(jìn)行檢測(cè)。本章基于花青染料

3、3-乙基-2-[7-(3-乙基-2-苯并噻唑啉)-1，3，5-庚三烯]碘化苯并噻唑與DNA雜交雙鏈的特異性結(jié)合作用，將DNA的雜交信號(hào)轉(zhuǎn)化為染料在可見(jiàn)光區(qū)的光吸收信號(hào)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與DNA雜交雙鏈結(jié)合后，該染料在760 nm處產(chǎn)生強(qiáng)吸收峰，吸光度數(shù)值及其穩(wěn)定性受雜交鏈長(zhǎng)度和體系溫度的影響。在25℃條件下，采用24-mer探針，可以檢測(cè)μg·mL-1數(shù)量級(jí)的互補(bǔ)DNA鏈，比DNA自身雜交信號(hào)靈敏度提高兩個(gè)數(shù)量級(jí)。在優(yōu)化條件下，利用該染料

4、還可識(shí)別短鏈DNA中存在的SNP。與其它DNA片段的檢測(cè)以及SNP的識(shí)別方法相比，該方法更為簡(jiǎn)便迅速，在臨床診療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
　　 二、反膠束介質(zhì)調(diào)控DNA雜交反應(yīng)的研究
　　 DNA雜交反應(yīng)前后，在260 nm處的吸光度會(huì)有變化。雜交雙鏈匹配度不同，吸光度的變化幅度不同。這一光吸收信號(hào)可以采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)。但是，水溶液中進(jìn)行的DNA雜交反應(yīng)，濃度高至100μmol/L時(shí)，DNA分子的紫外吸光度超出儀器檢

5、測(cè)范圍。濃度低至1μmol/L，雜交前后吸光度的變化幅度小，也觀測(cè)不到吸光度的變化。
　　 反膠束介質(zhì)使局部濃集于水核中的DNA分子雜交，同時(shí)DNA的表觀濃度大大降低，反膠束介質(zhì)還降低了DNA的雜交反應(yīng)速度和雜交雙鏈的穩(wěn)定性，使不同匹配度DNA雙鏈的紫外吸光度產(chǎn)生差異，因此用紫外分光光度計(jì)即可檢測(cè)SNP。但是文獻(xiàn)研究表明反膠束中DNA雜交反應(yīng)速率太慢，單個(gè)樣品檢測(cè)周期約4小時(shí)。
　　 本章采用合成的24個(gè)堿基的DNA片段

6、，在AOT反膠束中研究了影響DNA雜交反應(yīng)速度的因素。采用析相的方法，使反膠束溶液兩相分離，析相后DNA仍存在于有機(jī)相(反膠束)中。析相后DNA鏈仍能進(jìn)行雜交反應(yīng)，雜交反應(yīng)速度加快。根據(jù)不同匹配度DNA鏈雜交后紫外吸光度，可以識(shí)別存在不匹配堿基的DNA鏈。利用庫(kù)侖滴定法測(cè)定有機(jī)相中水分含量，雙鏈不匹配度越高，有機(jī)相中水分含量越高，根據(jù)有機(jī)相中水分含量，也可以識(shí)別具有不匹配堿基的核苷酸鏈。
　　 三、DNA雜交信號(hào)的酶放大研究

7、r>　　 近年來(lái)，利用酶催化反應(yīng)轉(zhuǎn)換和放大各種檢測(cè)信號(hào)的方法越來(lái)越受到關(guān)注。2002年，Alan S.等人報(bào)道了利用生物工程修飾酶放大DNA檢測(cè)信號(hào)的方法，首次將DNA的雜交反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)換并放大為酶催化反應(yīng)信號(hào)。但是，該方法的局限性在于對(duì)酶、抑制劑和DNA的修飾連接過(guò)程太過(guò)復(fù)雜。
　　 核酸適配體是1990年被發(fā)現(xiàn)的一類特殊的寡核苷酸鏈，可以通過(guò)一種稱之為SELEX(systematic evolution of ligands

8、 by exponential enrichment)的離體選擇過(guò)程獲得。1992年通過(guò)SELEX篩選出凝血酶核酸適配體，可以抑制凝血酶對(duì)纖維蛋白原的水解活力。
　　 本章基于凝血酶與G15D核酸適配體的特異性結(jié)合原理，在G15D核酸適配體上修飾DNA分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)，修飾后的探針在溶液中形成G-四聚體和分子信標(biāo)兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，G-四聚體結(jié)構(gòu)域與凝血酶結(jié)合，抑制了凝血酶的水解活力。當(dāng)溶液中存在與分子信標(biāo)環(huán)部互補(bǔ)的DNA鏈時(shí)，由于DNA的

9、雜交反應(yīng)，使分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)被打開(kāi)，G-四聚體結(jié)構(gòu)被破壞，凝血酶復(fù)活。不同匹配度DNA鏈與探針鏈雜交后，探針的G-四聚體結(jié)構(gòu)被破壞的程度不同，凝血酶的活力不同，通過(guò)測(cè)定凝血酶的活力可以識(shí)別具有不匹配堿基的目標(biāo)鏈。凝血酶的活力用凝血酶水解纖維蛋白原的初凝時(shí)間表示。由于凝血酶凝血時(shí)間是臨床診斷中一種測(cè)定人體凝血功能的常規(guī)檢測(cè)方法，將SNP的識(shí)別信號(hào)轉(zhuǎn)化為凝血酶凝血時(shí)間，將易于在普通的診療機(jī)構(gòu)推廣應(yīng)用。
　　 四、核酸適配體對(duì)凝血酶的變構(gòu)

10、作用研究
　　 凝血酶與底物復(fù)合物結(jié)晶、凝血酶定點(diǎn)突變、分子模擬等方法常常用來(lái)研究凝血酶變構(gòu)作用。通過(guò)對(duì)凝血酶與凝血酶調(diào)制蛋白(thrombomodulin，TM)的結(jié)晶復(fù)合物檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)TM與凝血酶結(jié)合并沒(méi)有引起凝血酶構(gòu)象改變。但又有研究表明，TM結(jié)合于凝血酶使凝血酶對(duì)蛋白質(zhì)C的識(shí)別能力增強(qiáng)。對(duì)于外結(jié)合位點(diǎn)Ⅰ和Ⅱ之間是否有相互作用這一重要問(wèn)題，也始終沒(méi)有一致的結(jié)論，有的研究認(rèn)為兩個(gè)位點(diǎn)之間有構(gòu)象相關(guān)性，即外結(jié)合位點(diǎn)I與配體的結(jié)合

11、會(huì)使外結(jié)合位點(diǎn)Ⅱ失去與配體的結(jié)合能力，但是有些研究又認(rèn)為兩個(gè)位點(diǎn)之間沒(méi)有關(guān)聯(lián)。
　　 G15D核酸適配體特異性結(jié)合于凝血酶外結(jié)合位點(diǎn)Ⅰ，抑制凝血酶對(duì)纖維蛋白原的水解活力，抑制凝血酶與TM的結(jié)合。DNA60-18(29)核酸適配體結(jié)合于外結(jié)合位點(diǎn)Ⅱ，也抑制凝血酶對(duì)纖維蛋白原的水解活力。由于G15D核酸適配體和DNA60-18(29)核酸適配體本身并不被凝血酶水解，并且凝血酶水解發(fā)色底物的反應(yīng)不受核酸適配體的抑制，因此本章用核酸適配

12、體來(lái)研究外結(jié)合位點(diǎn)對(duì)凝血酶的變構(gòu)作用。
　　 本章我們選用核酸適配體研究外結(jié)合位點(diǎn)對(duì)凝血酶的變構(gòu)作用。首先，核酸適配體可以分別結(jié)合于凝血酶的兩個(gè)位點(diǎn)，本身不被凝血酶水解。其次，相對(duì)于TM、纖維蛋白原等大分子蛋白類底物，核酸適配體對(duì)酶構(gòu)象和活力檢測(cè)的干擾大大減小。此外，凝血酶水解小分子發(fā)色底物的反應(yīng)不被核酸適配體抑制，可以直接檢測(cè)凝血酶水解活力的變化。研究結(jié)果表明，核酸適配體與凝血酶的結(jié)合會(huì)引起凝血酶構(gòu)象的輕微改變，這種改變可以促

13、進(jìn)凝血酶對(duì)發(fā)色底物的水解。這一現(xiàn)象似乎可以說(shuō)明，大分子底物結(jié)合于凝血酶外結(jié)合位點(diǎn)，不僅有利于底物的酶切位點(diǎn)與凝血酶活性中心的接觸，還可以促進(jìn)凝血酶的水解活力。
　　 五、基于核酸適配體與凝血酶的相互作用測(cè)定凝血酶
　　 本章基于核酸適配體和凝血酶相互作用的研究結(jié)果，利用核酸適配體制作生物傳感器來(lái)檢測(cè)凝血酶。用方波電勢(shì)脈沖(SWPP)法制備納米多孔金電極，將巰基修飾的G15D核酸適配體固定在納米多孔金電極上，之后利用核酸適