生長抑素類似物預(yù)防和抑制原發(fā)性肝癌生長的研究.pdf

1、該研究通過肝癌細(xì)胞株體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)、大鼠肝癌誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn),觀察OCT預(yù)防肝癌形成、抑制肝癌生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的效果,對肝癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制和OCT的抑瘤機(jī)制進(jìn)行探索.第一部分生長抑素類似物對肝癌的抑制和其受體2的調(diào)節(jié).SSTA抑制腫瘤的生長機(jī)制,一般認(rèn)為是通過SSTRs的介導(dǎo)完成的,但作為G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein-coupled receptors,GPCR)的一種,SSTRs象其它GPCR類受體一樣,在介導(dǎo)配體發(fā)揮作用的同時,自身的

2、表達(dá)也受到配體的調(diào)節(jié),但關(guān)于肝癌在SST治療過程中SSTR的變化以及其對SST抑瘤效果的影響,目前尚未見相關(guān)報(bào)道.劉建生等檢測Bel 7402肝癌細(xì)胞株的SSTR2mRNA,發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞株呈現(xiàn)高密度的表達(dá).故該研究采用Bel7402肝癌細(xì)胞株,通過觀察OCT處理該細(xì)胞株的體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn),了解OCT的抑瘤效果和SSTR2mRNA和蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié).方法:將Bel7402肝癌細(xì)胞置于含10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中,在37℃、5%CO

3、2、飽和濕度的環(huán)境下培養(yǎng).首先,將細(xì)胞傳入96孔板,分成四組:A組為對照組,僅加入含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液;B、C、D組中除加入上述培養(yǎng)基外,還分別按終濃度0.002mg/ml、0.006mg/ml和0.01mg/ml的量加入OCT.用MTT比色試驗(yàn),連續(xù)觀察4天,檢測肝癌細(xì)胞的增殖情況.將細(xì)胞傳入6孔板中,分成兩組:OCT組加入含0.01mg/ml善寧的RPMI1640培養(yǎng)液,對照組在1640培養(yǎng)液中加入等量PBS液.

4、分別于24、48h在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化;通過傷痕試驗(yàn)觀察肝癌細(xì)胞遷徙無細(xì)胞帶的情況,了解細(xì)胞的侵襲能力;通過細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)了解肝癌細(xì)胞的粘附能力,公式:粘附率=(1-未粘附細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%;培養(yǎng)72h后,制成單細(xì)胞懸液,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞表面SSTR2的表達(dá),半定量RT-PCR的方法檢測細(xì)胞SSTR2mRNA的表達(dá).結(jié)論:1.SSTA可以有效抑制體內(nèi)肝癌種植瘤的生長,并預(yù)防肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,但短期抑制體外肝癌

5、細(xì)胞生長的效果并不明顯.2.SSTR2是SSTA抑制肝癌的重要介導(dǎo),但它同樣也受到SSTA的調(diào)節(jié),即短期SSTA處理引起肝癌細(xì)胞上SSTR2脫敏、內(nèi)化,SSTA的功效受到部分抑制;長期持續(xù)的治療可以導(dǎo)致肝癌細(xì)胞SSTR2表達(dá)的增加,有利于SSTA抑制肝癌作用的更好發(fā)揮.第二部分生長抑素類似物抑制肝癌分子機(jī)制的研究.該部分檢測Bel7402肝癌細(xì)胞及其種植瘤中cMet、TGFβ1、磷酸化Smad2、Smad4和Smad7的表達(dá),觀察OCT

6、對這些因子的影響,分析OCT抑瘤作用和這些信號傳導(dǎo)通路的關(guān)系.方法:同第一部分將培養(yǎng)細(xì)胞分成兩組:OCT組和對照組.流式細(xì)胞儀檢測Bel 7402細(xì)胞表面cMet的表達(dá);半定量RT-PCR檢測細(xì)胞的Smad4mRNA的表達(dá).裸鼠肝癌原位種植瘤模型和分組治療同第一部分;免疫組化檢測種植瘤的cMet、TGFβ1、磷酸化Smad2、Smad4和Smad7表達(dá);半定量RT-PCR檢測種植瘤的Smad4mRNA的表達(dá).結(jié)論:1.下調(diào)肝癌細(xì)胞上cM

7、et蛋白的表達(dá)可能是SSTA抑制肝癌生長、侵襲轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一.2.磷酸化Smad2表達(dá)的降低可能是Bel7402肝癌細(xì)胞的重要特征之一.SSTA可以顯著上調(diào)肝癌細(xì)胞Smad4的表達(dá),恢復(fù)或部分恢復(fù)TGF β/Smads系統(tǒng)的信號傳導(dǎo),達(dá)到抑制肝癌生長的效果.第三部分大鼠誘導(dǎo)肝癌過程中SSTR2、cMet、TGF β/Smads信號通路的變化和生長抑素類似物的影響.與其他絕大多數(shù)腫瘤一樣,肝癌的發(fā)生通常受多因素的作用,表現(xiàn)為多步驟、多

8、階段的復(fù)雜的演變過程,常常經(jīng)歷多種分子生物學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)方面的變化.該部分通過二乙基亞硝胺溶液(Diethylnitrosamine,DENA)誘發(fā)大鼠肝癌的模型觀察肝癌形成過程中SSTR2、cMet和TGF/Smads信號系統(tǒng)的變化,對肝癌的形成和發(fā)展機(jī)制進(jìn)行一定的探索,通過OCT對肝硬化大鼠的治療,觀察OCT預(yù)防肝癌形成的效果,分析其可能的機(jī)制.方法:1.大鼠化學(xué)誘導(dǎo)肝癌模型的制作:選擇6周齡雄性SD大鼠,體重110~180g,給予

9、新鮮配置的DENA代飲水,開始按0.05g/L的濃度給予,2周后改為0.1 g/L,同時給予標(biāo)準(zhǔn)塊狀食料喂養(yǎng),14周后改為正常飲水,共喂養(yǎng)22周.2.分組治療:在給DENA處理8周后,將大鼠隨機(jī)分為OCT組(n=8)和對照組(n=28):OCT組大鼠,給予腹腔注射0.1mg/kg善寧治療,對照組給予等量生理鹽水治療,均為每天一次,持續(xù)14周.3.標(biāo)本的獲取:分別于給藥后8周、16周和22周,麻醉下開腹,觀察肝臟情況,并切取肝臟或肝癌組織

10、.正常大鼠肝臟標(biāo)本5例,對照組誘癌8周和16周各7例,22周6例,OCT組誘癌8周8例,16周7例,22周4例,1例OCT組肝癌(16~22周間死亡).4.免疫組化:免疫組化檢測大鼠肝臟和肝癌上SSTR2、cMet、TGF β 1、磷酸化Smad2、Smad4和Smad7的表達(dá).5.半定量RT-PCR:半定量RT-PCR檢測SSTR2和Smad4的表達(dá).結(jié)論:1.肝癌的發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜,大鼠肝硬化晚期SSTR2或/和Smad4的表達(dá)的減