瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SARS-CoV M基因?qū)Υ笫蠓纬衫w維細(xì)胞生長(zhǎng)特性及生物學(xué)功能的影響.pdf

1、前言：嚴(yán)重急性呼吸綜合征(severeacuterespiratorysyndrome，SARS)是21世紀(jì)在全球暴發(fā)的第一種烈性傳染病，2002年11月我國(guó)廣東佛山市曾經(jīng)發(fā)生一起家族聚集性SARS疫情，2003年2月下旬從香港開始向其他國(guó)家蔓延。我國(guó)既是SARS暴發(fā)的起源地，也是疫情最嚴(yán)重的地區(qū)。SARS是由一種新型冠狀病毒引起的疾病，此型冠狀病毒基因組結(jié)構(gòu)與已知的其他冠狀病毒基因組結(jié)構(gòu)類似，完整的病毒顆粒呈球形，有包膜，核心由無(wú)分段

2、的單股正鏈RNA和堿性磷酸蛋白N組成，包膜表面覆蓋有規(guī)則排列的20-40nm長(zhǎng)的棒狀或花瓣?duì)畲掏?；包膜上主要有三種糖蛋白：S蛋白、M蛋白和E蛋白，其中S和M蛋白是主要的結(jié)構(gòu)性表面抗原，由病毒基因組S和M基因編碼。 M蛋白是病毒顆粒中含量最豐富的糖蛋白，它是由一個(gè)短的N端、3個(gè)連續(xù)的跨膜區(qū)和一個(gè)位于毒粒內(nèi)部的C端結(jié)構(gòu)域組成的一種Ⅲ型糖蛋白。編碼M蛋白的開放閱讀框(ORF)總長(zhǎng)為666個(gè)核苷酸，編碼221個(gè)氨基酸殘基。M蛋白的主要功

3、能包括：宿主高爾基體的整合膜蛋白、引發(fā)病毒顆粒的組裝、與病毒核衣殼N蛋白相互作用、形成病毒內(nèi)核的鞘和誘導(dǎo)α-干擾素等，而其中參與包膜的形成和參與核心的組成是M蛋白最主要的功能；此外M蛋白富含有效的中和表位，在誘發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)生成抗體及產(chǎn)生細(xì)胞毒性T細(xì)胞免疫反應(yīng)上起著重要的作用，因此研究M蛋白的結(jié)構(gòu)和功能對(duì)于了解SARS的免疫損傷機(jī)理、制備有效的疫苗都具有十分重要的意義。 SARS病毒通過(guò)肺組織損傷而引發(fā)肺纖維化已有報(bào)道，但對(duì)其具

4、體的表現(xiàn)形式和發(fā)病機(jī)制尚缺乏認(rèn)識(shí)。近年來(lái)我們課題組對(duì)肺纖維化發(fā)病機(jī)制已做了相當(dāng)?shù)难芯?，根?jù)以往的研究發(fā)現(xiàn)肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞的功能及分化、ECM合成和降解的平衡是肺纖維化發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。隨著防治SARS工作的不斷深入，研究肺纖維化發(fā)生發(fā)展的規(guī)律和機(jī)制、探索防治方法及途徑己成為當(dāng)務(wù)之急。 由于SARS具有很高的傳染性，所以對(duì)于SARS相關(guān)樣本方面的研究必須遵守相應(yīng)的生物安全防護(hù)規(guī)則，世界衛(wèi)生組織和中國(guó)衛(wèi)生部制定了SARS相關(guān)操作所

5、必須遵守的生物安全原則，鑒于開展活病毒研究的條件尚不具備、人體材料的應(yīng)用局限以及動(dòng)物SARS模型制備的條件限制，我們考慮先從SARS致肺纖維化的細(xì)胞模型入手，利用重組有SARS結(jié)構(gòu)蛋白基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞來(lái)觀察它對(duì)Fb生長(zhǎng)特性和生物學(xué)功能的影響。 目的：觀察轉(zhuǎn)SARS-CoVM基因的大鼠肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)特性及部分生物學(xué)功能的改變；初步探討SARS病毒致肺組織損傷并最終引發(fā)肺纖維化的可能的機(jī)制和途徑。 方法

6、：利用堿裂解法擴(kuò)增純化質(zhì)粒(包括重組質(zhì)粒pcDNA3．1-M和空載體pcDNA3．1)；酶消化法分離大鼠肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞：采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒入Fb；采用免疫熒光染色、RT-PCR和WesternBlot的方法鑒定轉(zhuǎn)染結(jié)果；在轉(zhuǎn)染后24、48和72小時(shí)用MTT比色法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)情況：收集轉(zhuǎn)染后48小時(shí)的細(xì)胞采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)大鼠肺成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)周期；收集轉(zhuǎn)染后48小時(shí)的細(xì)胞總RNA采用RT-PCR和Realtime-PC

7、R的方法觀察MMP-2的表達(dá)情況。 結(jié)果：根據(jù)免疫熒光、RT-PCR和WesternBlot的結(jié)果，M基因成功地瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞，表達(dá)產(chǎn)物有SARS-CoVM蛋白的抗原性；MTT和FCM顯示與轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞相比轉(zhuǎn)染了pcDNA3．1-M重組質(zhì)粒的細(xì)胞的生長(zhǎng)明顯增強(qiáng)，Go／G。期比例下降，S期比例增加，尤其在48小時(shí)這個(gè)變化最為明顯；轉(zhuǎn)染后48小時(shí)細(xì)胞MMP-2的表達(dá)較轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞表達(dá)明顯增強(qiáng)。 結(jié)論：成功