維甲酸相關(guān)孤核受體α在α-黑素細(xì)胞刺激素及其類似物STY39調(diào)控樹突狀細(xì)胞成熟中的作用.pdf

1、維甲酸相關(guān)孤核受體α(retinoid acid receptor related orphan receptor,RORα,NR1F1)是一種屬于類固醇激素受體超家族成員的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,它能夠直接進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄,從而參與多種重要生理過程的調(diào)節(jié),在形態(tài)發(fā)育、細(xì)胞增殖分化、機(jī)體穩(wěn)態(tài)維持、生物代謝調(diào)控、高級(jí)神經(jīng)功能控制以及免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)RORα基因缺陷的模型小鼠體內(nèi)出現(xiàn)了廣泛而嚴(yán)重的功能性障礙,尤其是容易罹

2、患自身免疫性疾病和過敏性疾病,并表現(xiàn)出明顯的免疫功能異常,如T細(xì)胞和B細(xì)胞功能缺陷、巨噬細(xì)胞釋放致炎因子(如IL-1、IL-6、TNF-α)增多等。可以推斷RORα與免疫系統(tǒng)的關(guān)系非常密切,其抗炎作用在多種疾病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷难芯恐幸训玫阶C實(shí)。
　　 α-黑素細(xì)胞刺激素(alpha-melanocyte-stimulating hormone,α-MSH)是一種內(nèi)源性小分子神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)肽,它不僅能促進(jìn)黑色素形成使皮膚變黑,而且具

3、有明確的抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用。α-MSH通過黑皮質(zhì)素受體(melanocortin receptor,MCR)的介導(dǎo)發(fā)揮多種生理功能,這些受體廣泛表達(dá)于各種組織,包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、外周組織及免疫細(xì)胞。目前已知的MCR共有5種亞型(MC1R～MC5R),除MC2R以外,其他受體均能結(jié)合α-MSH,其中MC1R和MC5R主要介導(dǎo)其抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。理論上,α-MSH作為天然的抗炎免疫調(diào)節(jié)劑可以用于自身免疫病、過敏性疾病的防治以及避免移植排斥

4、反應(yīng),但由于其結(jié)合受體的選擇性低,生物學(xué)作用不僅限于免疫調(diào)節(jié),還能同時(shí)影響機(jī)體其他神經(jīng)內(nèi)分泌功能,導(dǎo)致皮膚變黑等,限制了α-MSH的實(shí)際應(yīng)用。因此基于天然α-MSH結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和不同MCR亞型介導(dǎo)的效應(yīng),設(shè)計(jì)合成新的類似物將更具有應(yīng)用于臨床的前景。本實(shí)驗(yàn)室自主研制了α-MSH的新型類似物(專利授權(quán)號(hào)ZL200510026927.3,命名為STY39),是一種對(duì)MC1R與MC5R均具有高選擇性的激動(dòng)劑。經(jīng)前期實(shí)驗(yàn)已證明,STY39對(duì)LPS誘導(dǎo)

5、的內(nèi)毒素休克小鼠和博萊霉素誘導(dǎo)的急性肺部炎癥和肺纖維化大鼠具有很好的保護(hù)作用,能顯著抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)組織因子而上調(diào)組織因子途徑抑制因子的表達(dá),還能顯著下調(diào)晚期炎癥因子高遷移率族蛋白B1(HMGB1)的表達(dá)以有助于控制炎癥發(fā)展。
　　 樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)是機(jī)體內(nèi)功能最強(qiáng)的專職抗原提呈細(xì)胞,承接固有免疫和適應(yīng)性免疫,是啟動(dòng)、調(diào)控和維持適應(yīng)性免疫應(yīng)答的關(guān)鍵。DCs的功能與其成熟狀態(tài)密切相關(guān):成熟D

6、Cs能有效激活免疫應(yīng)答,在抗腫瘤、抗感染免疫方面意義重大；而非成熟DCs具有致免疫耐受性,在防治移植排斥和自身免疫病方面具有重要意義。本課題組在探究α-MSH對(duì)DCs分化成熟的調(diào)控作用中,已明確α-MSH可以抑制人外周血單核細(xì)胞來源DCs的發(fā)育成熟,且提示可能與RORα蛋白表達(dá)增高相關(guān)。聯(lián)系已知關(guān)于RORα在抗炎過程中發(fā)揮的確切效應(yīng)以及在細(xì)胞增殖分化中的作用,我們推測RORα亦可能參與DCs分化成熟的調(diào)控過程。因此本課題將深入研究ROR

7、α是否與DCs的分化發(fā)育有關(guān),RORα在α-MSH調(diào)控DCs分化成熟中的作用與機(jī)制,迄今為止尚未見類似報(bào)道。本課題研究內(nèi)容共分為以下四個(gè)部分。
　　 第一部分α-MSH及其類似物STY39對(duì)DCs表達(dá)RORα的影響
　　 目的:探明不同濃度α-MSH或其類似物STY39作用與RORα表達(dá)量之間的關(guān)系。方法:利用體外分離培養(yǎng)的小鼠骨髓來源DCs作為研究對(duì)象,用50 ng/ml TNF-α刺激DCs(TNF-α-DCs),誘

8、導(dǎo)DCs成熟,再分別以不同濃度α-MSH或STY39(10-6 mol/L、10-8 mol/L、10-10 mol/L和10-12 mol/L)處理。然后于作用不同時(shí)間點(diǎn),通過Westernblotting法和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測RORα的蛋白和基因表達(dá)水平。結(jié)果:TNF-α-DCs中RORα蛋白和mRNA表達(dá)較對(duì)照組降低,在α-MSH(10-8、10-10 mol/L)或STY39(10-10 mol/L)作用后,RORα

9、蛋白和mRNA的表達(dá)量均明顯增加(P<0.05)。
　　 結(jié)論:α-MSH或STY39可以上調(diào)TNF-α刺激的小鼠骨髓來源DCs中RORα的表達(dá)。
　　 第二部分高表達(dá)RORα對(duì)TNF-α誘導(dǎo)DCs成熟的影響
　　 目的:觀察RORα在細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)是否影響DCs的發(fā)育成熟。
　　 方法:首先構(gòu)建rAAV-RORα-hrGFP重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染TNF-α-DCs,獲得高表達(dá)RORα的DCs(rAAV-RORα-

10、hrGFP-TNF-α-DCs),然后觀察其表型變化和功能狀態(tài)。用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測DCs表型(Iab、CD86、CD54)；采用FITC-BSA吞噬實(shí)驗(yàn)并經(jīng)FCM分析DCs吞噬抗原功能的變化;以3H-TdR摻入法測定DCs刺激抗原特異性T細(xì)胞增殖的能力；ELISA檢測DCs產(chǎn)生IL-6、IL-12、IL-10的水平。
　　 結(jié)果:與rAAV-IRES-hrGFP-TNF-α-DCs(空載體對(duì)照)相比,rAAV-RORα-

11、hrGFP-TNF-α-DCs呈現(xiàn)以下變化:①Iab、CD86、CD54分子的表達(dá)明顯下調(diào)；②吞噬FITC-BSA的功能增強(qiáng)(P<0.05)；③刺激抗原特異性T細(xì)胞增殖的能力明顯減弱(P<0.01)；④IL-6和IL-12的分泌減少(P<0.05),而IL-10的分泌水平明顯上升(P<0.01)。
　　 結(jié)論:使TNF-α刺激的DCs內(nèi)高表達(dá)RORα可以抑制DCs的發(fā)育成熟。
　　 第三部分 RORα生α-MSH及其類似

12、物STY39抑制DCs成熟中的作用
　　 目的:研究RORα在α-MSH或STY39抑制DCs成熟過程中的作用。
　　 方法:設(shè)計(jì)合成RORα的siRNAs,采用RNA干擾技術(shù)沉默TNF-α-DCs中RORα mRNA的表達(dá),觀察10-10 mol/Lα-MSH或STY39作用后[即α-MSH(or STY39)-RORα-siRNA-TNF-α-DCs],是否改變其成熟狀態(tài)。測定指標(biāo)包括:DCs的表型(Iab、CD86

13、、CD54)、吞噬功能、刺激抗原特異性T細(xì)胞增殖的能力以及產(chǎn)生IL-6、IL-12、IL-10的水平,方法同第二部分。
　　 結(jié)果:與α-MSH(or STY39)-non-siRNA-TNF-α-DCs(非特異性干擾對(duì)照組)相比,α-MSH(or STY39)-ROR-siRNA-TNF-α-DCs發(fā)生如下改變:①Iab、CD86、CD54分子的表達(dá)水平明顯增高；②吞噬BSA抗原的功能降低(P<0.05)；③刺激抗原特異性T細(xì)

14、胞增殖的能力增強(qiáng)(α-MSH,P<0.05；STY39,P<0.01)；④IL-6和IL-12的分泌水平升高(P<0.05),而IL-10的分泌減少(α-MSH,P<0.05；STY39,P<0.01)。
　　 結(jié)論:α-MSH或STY39抑制TNF-α-DCs成熟可能部分地通過誘導(dǎo)RORα高表達(dá)介導(dǎo)。
　　 第四部分RORα參與α-MSH及其類似物STY39抑制DCs成熟的機(jī)制
　　 目的:探討RORα參與α-

15、MSH及其類似物STY39抑制DCs成熟的相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　 方法:①將DCs分為:未成熟對(duì)照組(imDCs)、50 ng/ml TNF-α刺激組(TNF-α-DCs)、10-10 mol/Lα-MSH或STY39處理組[α-MSH(or STY39)+TNF-α-DCs]、rAAV-RORα-hrGFP-TNF-α-DCs組和rAAV-IRES-hrGFP-TNF-α-DCs(空載體對(duì)照)組,用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的

16、方法檢測不同處理組α-MSH的天然受體(MC-1～5R)的表達(dá)情況;②利用各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路特異性阻斷劑包括SB203580(p38/MAPK)、GF10933X(PKC)、H89(PKA)、PD98059(ERK1/ERK2)和PDTC(NF-κB)等分別作用于經(jīng)10-10 mol/Lα-MSH或STY39+TNF-α處理的DCs,然后采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測各組RORα的mRNA表達(dá)情況;③通過Western blot檢測

17、TNF-α-DCs高表達(dá)RORα后細(xì)胞內(nèi)NF-κB p65和IκBα蛋白的表達(dá)情況；④采用雙熒光素酶報(bào)告基因法檢測TNF-α-DCs高表達(dá)RORα后以及STY39+TNF-α-DCs的RORα被干擾表達(dá)后NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。
　　 結(jié)果:①M(fèi)C-1～5R可組成性表達(dá)于DCs,TNF-α作用后可上調(diào)MC1R和MC5R的表達(dá)量(P<0.01),下調(diào)MC3R和MC4R的表達(dá)量(P<0.05)；②α-MSH和STY39均能上調(diào)TNF-

18、α-DCs的MC1R表達(dá)(P<0.05),STY39還能上調(diào)imDCs的MC5R表達(dá)(P<0.05)；③細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)RORα可使imDCs和TNF-α-DCs表達(dá)MC1R增加(P<0.05)；④經(jīng)α-MSH或STY39+TNF-α刺激的DCs,使用阻斷劑SB203580、GF10933X或H89作用后,RORα mRNA的表達(dá)量均明顯降低(P<0.01)；⑤高表達(dá)RORα可顯著減少TNFα-DCs胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白含量、增加胞

19、漿內(nèi)IκBα蛋白含量,同時(shí)抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性(P<0.01)；干擾RORα表達(dá)的TNFα-DCs在STY39作用后,NF-κB轉(zhuǎn)錄活性明顯高于未干擾對(duì)照組(P<0.05)。
　　 結(jié)論:在α-MSH或STY39抑制TNF-α誘導(dǎo)DCs成熟的過程中,可由MCR介導(dǎo)通過多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(p38/MAPK、PKC、PKA)上調(diào)RORα在TNF-α-DCs中的表達(dá)。高表達(dá)RORα一方面通過上調(diào)IκBα蛋白表達(dá)量、抑制NF-κB的轉(zhuǎn)

20、核與轉(zhuǎn)錄活性,導(dǎo)致DCs的成熟信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻；另一方面可誘導(dǎo)MCR表達(dá)以進(jìn)一步增強(qiáng)起始信號(hào),從而發(fā)揮抑制DCs分化成熟的作用。
　　 綜上所述,本課題發(fā)現(xiàn)RORα參與了DCs發(fā)育成熟的調(diào)控；在α-MSH或其類似物STY39抑制TNF-α誘導(dǎo)DCs成熟的過程中,RORα發(fā)揮了非常關(guān)鍵的作用；α-MSH或STY39可通過MCR介導(dǎo)下游多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(如p38/MAPK、PKC、PKA等)使RORα的表達(dá)增加,并使TNF-α刺激的DC