雙單抗夾心檢測(cè)氧化低密度脂蛋白技術(shù)及初步臨床應(yīng)用.pdf

1、背景：氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)是動(dòng)脈粥樣硬化(AS)發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因子。近年來(lái)大量文獻(xiàn)報(bào)道Ox-LDL可在外周血中測(cè)出，且證實(shí)高水平的Ox-LDL同AS,性疾病有相關(guān)性，但是，迄今為止國(guó)內(nèi)檢測(cè)外周血Ox-LDL的方法仍未確立。“雙單抗夾心”檢測(cè)技術(shù)具有敏感度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、結(jié)果易觀察的特點(diǎn)，是一種頗為理想的微量測(cè)定技術(shù)。 目的：制備和篩選Ox-LDL單克隆抗體，建立“雙單抗夾心”檢測(cè)血清Ox-LDL技術(shù)，并初步

2、探討其臨床意義。 方法：密度梯度超速離心法自人血漿分離LDL(1.019～1.063g/ml)，LDL在20μMCuSO4存在條件下氧化8小時(shí)，制備Ox-LDL。將Ox-LDL經(jīng)腹腔免疫Balb/c小鼠，將其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)融合，經(jīng)HAT、HT選擇性培養(yǎng)，間接ELISA法篩選，選擇對(duì)Ox-LDL陽(yáng)性，對(duì)LDL陰性的多克隆孔進(jìn)行亞克隆，鑒定培養(yǎng)細(xì)胞上清。收集陽(yáng)性細(xì)胞株，注射Babl/c小鼠制備腹水，亞型鑒定，Pro

3、teinA柱親和層析法純化腹水中McAb，并行SDS-PAGE電泳，ELISA，Westernblot蛋白印跡術(shù)分析等鑒定其生物學(xué)活性。經(jīng)兩兩配對(duì)比較實(shí)驗(yàn)，確定最佳配對(duì)的兩株單抗，建立“雙單抗夾心”檢測(cè)Ox-LDL方法。收集173例門診體檢血脂正常人群，60例LP(a)升高，79例TG升高，107例LDL-C升高的血脂異常人群血清，采用建立的“雙單抗夾心”方法檢測(cè)Ox-LDL水平。 結(jié)果：經(jīng)細(xì)胞融合，HAT、HT選擇性培養(yǎng)，間接

4、ELISA法篩選獲得2株能穩(wěn)定分泌Ox-LDLMcAb的雜交瘤細(xì)胞株，2株McAb免疫球蛋白亞類鑒定均為IgG1類；染色體數(shù)目范圍為100～106條，2株McAb腹水效價(jià)為105，Westernblot分析和ELISA檢測(cè)證實(shí)2株McAb與Ox-LDL有較高的特異性及敏感性。經(jīng)兩兩配對(duì)比較實(shí)驗(yàn)，確定6D11單抗最佳包被濃度為5μg/ml，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的3B10單抗最佳稀釋度為1∶2000，據(jù)此建立“雙單抗夾心”方法。檢測(cè)

5、Ox-LDL靈敏度為3ng/ml；批間重復(fù)20次，批內(nèi)重復(fù)18次，各濃度點(diǎn)批間及批內(nèi)變異系數(shù)(CV)均＜10﹪。以本法測(cè)定173例門診體檢血脂正常人群血清Ox-LDL水平，結(jié)果表明Ox-LDL呈正態(tài)分布，其正常參考值范圍為0～544.1μg/ml。LP(a)升高，TG升高，LDL-C升高的血脂異常人群血清Ox-LDL水平分別為565.0±135.9μg/ml，635.4±123.5μg/ml，740.7±184.5μg/ml，與正常對(duì)照