促紅細胞生成素治療宮內感染致新生大鼠腦白質損傷的研究.pdf

1、目的： 早產兒腦白質損傷(whitematterdamage，WMD)被認為是腦癱發(fā)生的最主要的危險因素，給家庭和社會帶來了巨大的負擔。目前，早產兒WMD的機制尚不十分清楚，流行病學和動物實驗研究均表明宮內感染在早產兒。WMD的發(fā)生機制中起重要作用。WMD的病理特點主要是腦白質的凝固性壞死，壞死部位出現反應性星形膠質化、少突膠質細胞的丟失、髓鞘損傷和軸突損害。近年來研究認為，WMD的發(fā)生與腦內細胞因子的關系非常密切。細胞因子能以

2、多種機制導致腦白質損傷：1．損傷少突膠質細胞、星形膠質細胞、髓鞘和軸突等；2．通過誘導其他細胞因子而進一步產生細胞損害；3．介導一氧化氮(nitricoxide，NO)的神經毒性作用等。宮內感染導致早產兒WMD的機制可以推測為由細胞因子介導的一系列腦組織中各種細胞和蛋白合成的變化所致。 近年來的研究發(fā)現促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)在腦和其它臟器中具有促紅細胞生成以外的其它重要功能。EPO可能作為一種中樞

3、神經系統(tǒng)炎癥病理變化中的保護性細胞因子，對腦內的免疫反應有保護作用，這一作用可能通過影響腦內細胞因子的合成并發(fā)揮生物效應來實現。研究表明外周靜脈或腹腔內注入重組人促紅細胞生成素(recombinanthumanerythropoietin，rhEPO)能通過血腦屏障而直接在腦內產生神經保護作用。目前國內外對EPO與腦損傷的關系及機制研究主要集中于EPO對缺氧缺血性腦損傷的神經保護作用，而EPO與早產兒WMD的關系以及相關機制研究目前仍較

4、少。 因此，本研究通過建立官內感染導致WMD的新生大鼠模型，并給宮內感染后的新生大鼠腹腔注射一定劑量的rhEPO，觀察rhEPO干預對宮內感染后的新生大鼠腦白質中的2’，3’—環(huán)核苷3’—磷酸二脂酶(2'，3'—cyclicnucleotide3'—phosphodiesterase，CNPase)、神經微絲(neurofilament，NF)和膠質纖維酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP

5、)表達水平的影響；觀察rhEPO干預對宮內感染后的新生大鼠腦內細胞因子和誘導型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase，iNOS)的基因表達以及NO含量的影響，從細胞、分子水平來說明EPO對官內感染導致的新生大鼠WMD可能存在的治療作用。該研究將為臨床治療早產兒WMD提供豐富的動物實驗信息及依據，為今后進一步研究早產兒WMD的防治提供新的途徑。 方法： 1．實驗分組：對照組1(A組)、對照組

6、2(B組)、宮內感染組(C組)、宮內感染+rhEPO低劑量治療組(D組)、宮內感染+rhEPO中劑量治療組(E組)、官內感染+rhEPO高劑量治療組(F組)，每組8只SD孕鼠。對照組1為正常對照，對照組2為胎齡15天的孕鼠左右兩側官頸內備注射生理鹽水0.2mL，官內感染組為胎齡15天的孕鼠左右兩側宮頸內各注射大腸桿菌稀釋液0.2mL，宮內感染+rhEPO低(中、高)劑量治療組為宮內感染母鼠分娩后，新生大鼠于生后即刻腹腔注射1000(30

7、00、5000)IU/kgrhEPO。 2．標本采集：按照新生1、3，7日齡分別隨機選取各組中的新生大鼠經斷頭處死，迅速取出腦組織，將腦組織中性甲醛固定、石蠟包埋，或將腦組織經液氮速凍后-80℃冰箱中保存。 3．實驗方法：應用蘇木素—伊紅(hematoxylineosin，HE)染色觀察各組新生1、3、7日齡大鼠腦室周圍白質組織病理變化特點。免疫組化染色檢測各組新生1、3、7日齡大鼠腦組織CNPase、NF和GFAP的表

8、達，Westernblot檢測各組新生1、3、7日齡大鼠腦組織CNPase、NF和GFAP的蛋白水平，熒光定量RT—PCR檢測各組新生1、3、7日齡大鼠腦內細胞因子腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor，TNF)—α、白細胞介素(inrerieukin，IL)-1β、巨噬細胞炎性蛋白(macrophageinflammatoryprotein，MIP)-1α、MIP-1βmRNA和iNOSmRNA的表達，硝酸還原酶法檢測各

9、組新生1、3、7日齡大鼠腦內的NO含量。 結果： 1.48只孕鼠活動、進食均正常，無1例發(fā)生死亡。孕鼠分娩情況：A組共92只幼鼠，B組共85只幼鼠，c組共84只幼鼠，D組共89只幼鼠，E組共95只幼鼠，F組共78只幼鼠。宮內大腸桿菌感染的孕鼠子宮壁及胎盤內血管充血、水腫，并見大量中性粒細胞浸潤。對照組的孕鼠子宮及病理檢測均未見明顯的炎癥反應。 2．新生7日齡大鼠腦室周圍白質部位HE染色可見：A、B兩組腦白質組織結

10、構正常，染色清晰；C、D兩組腦白質染色淡，結構稀疏呈篩網狀改變；E組腦白質染色偏淡，結構稀疏化程度較C組有所減輕；F組腦白質染色清晰，結構稀疏化程度較C組明顯減輕。 3．宮內感染后的新生7日齡大鼠腦組織CNPase、NF表達顯著下降，rhEPO治療使宮內感染后的新生7日齡大鼠腦組織CNPase、NF表達有所上升。C組新生7日齡大鼠腦組織CNPase、NF蛋白水平較A、B兩組均顯著降低，E、F兩組CNPase蛋白水平則較C組顯著升

11、高，F組NF蛋白水平亦較C組顯著升高。宮內感染后的新生7日齡大鼠腦組織GFAP表達顯著上升，rhEPO治療使宮內感染后的新生7日齡大鼠腦組織GFAP表達有所下降。C組新生7日齡大鼠腦組織GFAP蛋白水平較A、B兩組顯著升高，F組GFAP蛋白水平則較C組顯著降低。 4．宮內感染后新生1日齡大鼠腦內TNF—αmRNA的表達水平顯著升高，中、高劑量的rhEPO治療使宮內感染后新生1日齡大鼠腦內TNF—αmRNA的表達水平顯著下降。宮內

12、感染后新生1、3日齡大鼠腦內IL-1βmRNA的表達水平顯著升高，中、高劑量的rhEPO治療使宮內感染后新生大鼠1日齡腦內IL-1βmRNA的表達水平顯著下降。宮內感染后新生1、3日齡大鼠腦內MIP-1αmRNA的表達水平顯著升高，高劑量的rhEPO治療使官內感染后新生1、3日齡大鼠腦內MIP-1αmRNA的表達水平顯著下降。宮內感染后新生1日齡大鼠腦內MIP-1βmRNA的表達水平顯著升高，中、高劑量的rhEPO治療使宮內感染后新生1

13、日齡大鼠腦內MIP-1βmRNA的表達水平顯著下降。 5．宮內感染后新生1、3日齡大鼠腦內iNOSmRNA的表達水平顯著升高，中、高劑量的rhEPO治療使宮內感染后新生1、3日齡大鼠腦內iNOSmRNA的表達水平顯著下降。官內感染后新生1、3日齡大鼠腦內NO含量顯著升高，高劑量的rhEPO治療使宮內感染后新生1、3日齡大鼠腦內NO含量顯著下降。 結論： 1．宮頸接種大腸桿菌建立的宮內感染大鼠模型能導致新生大鼠腦白

14、質結構產生稀疏化表現，宮內感染后新生大鼠的腦白質組織存在少突膠質細胞損傷、軸突損害和反應性星形膠質化，提示宮內感染能夠導致新生大鼠WMD。 2．通過給宮內大腸桿菌感染后的新生大鼠生后即刻腹腔注射一定劑量的rhEPO能夠減輕官內感染后新生大鼠腦白質出現的少突膠質細胞損傷、軸突損害和反應性星形膠質化，提示EPO對宮內感染導致的新生大鼠WMD具有一定的治療作用。 3．宮內大腸桿菌感染后新生大鼠腦內的細胞因子TNF-α、IL-1

15、β、MIP-1α和MIP-1βmRNA在生后早期有一過性表達增高的特點，提示由官內感染導致的細胞因子級聯反應在WMD的發(fā)生、發(fā)展中起著關鍵作用。 4．通過給宮內大腸桿菌感染后的新生大鼠生后即刻腹腔注射一定劑量的rhEPO可以抑制宮內感染后新生大鼠腦內細胞因子TNF-α、IL-1β、MIP-1α和MIP-1βmRNA的一過性表達增高，提示在宮內感染致新生大鼠WMD的早期炎癥反應階段，EPO可能通過抑制官內感染后新生大鼠腦內細胞因子

16、的大量表達，減輕炎癥反應，從而起到保護作用。 5．宮內大腸桿菌感染后新生大鼠腦內iNOSmRNA在生后早期有一過性表達增高的特點，并相應出現NO含量的一過性升高，提示iNOS與其誘導產生的NO在宮內感染導致早產兒WMD的過程中可能起重要作用。 6．通過給官內大腸桿菌感染后的新生大鼠生后即刻腹腔注射一定劑量的rhEPO可以抑制宮內感染后新生大鼠腦內iNOSmRNA的一過性表達增高和NO含量的一過性升高，提示在宮內感染致新生