蜂膠黃酮對CD44CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響及與動脈粥樣硬化的關(guān)系.pdf

1、既往研究表明蜂膠黃酮具有確切的抗動脈粥樣硬化功能，其作用機(jī)制也有較為詳細(xì)的研究，但仍不明確。已知CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對動脈粥樣硬化具有抑制作用，蜂膠黃酮是否通過影響CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量和/或功能從而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用，目前尚未見報道。本研究通過實驗動物模型探討蜂膠黃酮對CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及動脈粥樣硬化的影響。
　　 目的：⑴探討驗證蜂膠黃酮與血脂、NO、NOS、ET、VEGF等指標(biāo)的關(guān)

2、系；⑵進(jìn)一步驗證蜂膠黃釃的抗動脈粥樣硬化作用；⑶明確蜂膠黃酮是否通過影響CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量和/或功能，從而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用。
　　 方法：用超聲波輔助乙醇提取法提取蜂膠黃酮，采用硅膠柱層析純化蜂膠總黃酮，分光光度計法鑒定蜂膠黃酮純度。利用7-8周齡雄性ApoE-/-小鼠建立動脈粥樣硬模型，隨機(jī)分為4組，每組10只。分別為：①高脂組(HL組)：高脂飼料飼養(yǎng)；②正常對照組(NC組)：普通飼料飼養(yǎng)；③高脂+蜂膠

3、黃酮組(HP)：高脂飼料飼養(yǎng)并且給予蜂膠黃酮300mg.kg-1.d-1；④蜂膠黃酮組(PF組)：普通飼料飼養(yǎng)并給予蜂膠黃酮300mg.kg-1.d-1。連續(xù)灌胃給藥14周，內(nèi)眥靜脈取血，離心獲得血清，然后采用生化分析儀檢測其中甘油三脂(TG)、膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)和極低密度脂蛋白(VLDL)濃度；硝酸還原酶法檢測血清一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)濃度；酶聯(lián)免疫雙抗體夾心法(ELISA

4、)檢測血清內(nèi)皮素(ET)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)濃度；取小鼠整條動脈，進(jìn)行油紅O染色分析整條主動脈AS斑塊面積占整條主動脈面積的比例；取小鼠脾臟研磨、過濾獲得脾細(xì)胞后進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)24小時后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例；從小鼠脾臟細(xì)胞提取mRNA以RT-PCR法檢測Foxp3mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果：⑴血液TG濃度HL組、HP組、NC組和PF組依次降低，分別是：

5、HL組16.04±1.41mmol/L，HP組13.97±1.34mmol/L、NC組10.00±1.51mmol/L，PF組6.92±1.04mmol/L。方差分析表明HL組、HP組、NC組TG濃度顯著高于PF組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。同樣，血液LDL濃度HL組、HP組、NC組和PF組亦逐漸降低，分別是：HL組11.05±1.81mmol/L，HP組8.82±0.91mmol/L，NC組7.38±1.04mmol/L，

6、PF組6.16±0.96mmol/L。方差分析表明HL組、HP組、NC組LDL濃度顯著高于PF組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。⑵PF組、NC組、HP組、HL組血清NO濃度依次降低，分別為87.40±6.56umol/L、80.38±6.75umol/L、80.18±7.13umol/L、71.64±6.13umol/L。方差分析表明HL組、HP組、NC組TG濃度顯著低于PF組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。⑶PF組血清T

7、NOS濃度(20.14±5.99U/mL)顯著低于HL組(45.48±7.38U/mL)、HP組(40.32±5.91U/mL)、NC組(36.70±5.70U/mL)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。PF組血清iNOS濃度(15.06±3.34U/mL)顯著低于HL組(39.11±5.25)、HP組(34.49±2.80U/mL)和NC組(31.66±2.73U/mL)，方差分析表明差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。HL組血清

8、TNOS、iNOS水平均顯著高于NC組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，HP組與NC組間血清TNOS、iNOS差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。⑷方差分析表明，PF組血清ET濃度顯著低于HL組(57.04±6.20ng/Lvs82.194±6.85ng/L)，NC組(73.42±6.21ng/L)和HP組(78.42±5.81ng/L)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。HP組和NC組血清ET差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。NC

9、組低于HL組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。⑸PF組動脈粥樣硬化面積/整條動脈面積顯著低于HL組(0.20±0.06ratio vs0.44±0.05ratio)，也顯著低于PF組(0.38±0.06ratio)和NC組(0.35±0.07ratio)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；HP組和NC組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；HP組和NC組動脈粥樣硬化面積/整條動脈面積顯著低于HL組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。⑹P

10、F組血清VEGF濃度顯著低于HL組(78.90±13.13ng/Lvs155.62±23.96ng/L)，也顯著低于NC組(123.28±16.83ng/L)和HP組(135.85±15.65ng/L)，方差分析表明，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。HL組高于NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。HP組和NC組血清ET之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。⑺方差分析表明，PF組的CD4+CD25+Foxp3+Treg比例(5.55

11、±0.77％)顯著高于HL組(2.79±0.67％)也高于HP組(4.31±0.69％)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。HP組低于NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。PF組和NC組(5.49±0.91％)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。⑻方差分析表明PF組Foxp3mRNA表達(dá)水平顯著高于HL組(1.50±0.66copies/ul vs0.77±0.37copies/ul)也高于HP組(1.38±0.23copies

12、/ul)和NC組(1.43±0.13copies/ul)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。HP組與NC組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(詳見表12)HL組Foxp3mRNA表達(dá)水平低于NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：①蜂膠黃酮可以降低ApoE-/-小鼠血清TG、TC、LDL、VLDL濃度；升高小鼠血清NO濃度，降低血清iNOS和ET濃度；②蜂膠黃酮可以抑制ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化發(fā)展，降低血