單通道雙酶同步測定及其免疫分析應用.pdf

1、多酶同步分析可顯著提高檢測效率。已有的用兩種酶標記的單通道測量兩組分的ELISA技術，并沒有實現單通道兩種酶同步反應和同步檢測。本實驗室建立了基于等吸收波長原理的單通道雙酶同步分析方法（簡稱SDESA），并將其成功應用于ELISA（簡稱SDESA-ELISA），該方法在同一體系中，同時啟動并同步監(jiān)測所有標記酶的反應。SDESA的技術關鍵在于選擇一對合適的顯色底物和一對合適的標記酶，并建立消除吸收重疊干擾和混合體系中物質干擾的數據處理方法

2、，從而使SDESA-ELISA的檢測限、靈敏度及線性范圍與單組份ELISA相當。為解決上述問題，本實驗室對SDESA進行了下列研究:
　　1.復雜動力學體系雙酶同步測定-建立消除干擾的數據處理方法
　　用于單通道雙酶同步測定的兩種酶需滿足以下要求:(a)酶A作用于底物A生成產物A，酶B作用于底物B生成產物B。產物A的最大差吸收峰(λA)遠遠大于產物B的最大差吸收峰(λB)，且λB在產物A和底物A的最大等吸收波長(λO)附近。

3、(b)λA和λO處的光吸收值通過快速變換檢測波長進行定量，基于吸收的線性加和性消除吸收重疊干擾。(c)通過反應曲線動力學分析消除體系中物質對待測酶的干擾（抑制或激活）。(d)如果底物A的濃度低于其米氏常數，則選用本實驗室建立的聯(lián)用策略對酶A進行定量。
　　分析γ-谷氨酰基轉移酶(GGT)和乳酸脫氫酶(LDH)同步測定的復雜動力學過程，并以此作為SDESA的化學計量學模型。GGT作用于γ-谷氨酰基-對硝基苯胺(GGPNA)，釋放出對

4、硝基苯胺(PNA)，PNA最大差吸收峰λA在405 nm附近，GGPNA和PNA的最大等吸收波長λO在344 nm; LDH消耗還原態(tài)尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH，還原型輔酶Ⅰ)，NADH的最大差吸收峰λB在340 nm。通過對反應過程的動力學分析，消除了PNA對LDH的抑制作用;通過聯(lián)用策略測定的GGT初速度線性范圍以及消除干擾后的LDH線性范圍都與各自單獨測定時的線性范圍相當;當一種酶的活力相當于另一種酶的25倍時，活力較低的酶

5、通過SDESA的定量限仍然與單獨測定時相當。
　　2.簡單動力學體系的雙酶同步測定及在免疫分析中的應用（一）
　　為了探索SDESA的潛在應用價值，牛小腸堿性磷酸酶(ALP)和β-D-半乳糖苷酶(BGAL)被用作酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)的標記酶，用于小分子半抗原的單通道同步測定。ALP作用于4-硝基-1-萘酚磷酸酯(4NNPP)，釋放出4-硝基-1-萘酚(4NNP)，4NNP最大差吸收峰λA在458 nm，4NNPP和

6、4NNP的最大等吸收波長λO在405 nm;BGAL作用于對硝基苯酚-β-D-半乳糖苷(PNPG)，釋放出4-硝基苯酚(4NP)，4NP的最大差吸收峰λB在405 nm。由于不存在底物或產物間的干擾，ALP和BGAL的組合可用于ELISA同步分析單通道內的青霉素G和克倫特羅。結果表明，任意一個半抗原同步測定時的定量限均與單獨測定時基本相當，因此，SDESA具有廣闊的應用前景;獲得一對恰當的顯色底物和一對適當的標記酶是其應用于ELISA的

7、關鍵。
　　3.簡單動力學體系的雙酶同步測定及在免疫分析中的應用（二）
　　通常情況下，糖苷酶之間都具有良好的緩沖液兼容性，且?guī)缀醪淮嬖诘孜锘虍a物的相互干擾。BGAL水解4-硝基-1-萘酚-β-D-半乳糖苷(4NNPG)，釋放出4-硝基-1-萘酚(4NNP)，4NNP最大差吸收峰λA在458 nm左右，4NNPG和4NNP的最大等吸收波長λO在400 nm;α-D-葡萄糖苷酶(AGLU)作用于對硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷(4

8、NPG)，釋放出4-硝基苯酚(4NP)，4NP的最大差吸收峰λB在400 nm。這種特性使得BGAL和AGLU可作為同步分析ELISA的標記酶，通過快速變換檢測波長，同時測定405 nm和450 nm的吸收。事實上，用青霉素G標記的BGAL和克倫特羅標記的AGLU作為示蹤劑的競爭性ELISA，單通道內青霉素G和克倫特羅同步測定的結果都與單獨測定的結果具有良好的一致性，對于任意一種半抗原，同步測定的精密度和回收率均與單獨測定時相當。因此，

9、對一個作用于底物產生4-硝基-1-萘酚的糖苷酶和另一個作用于底物產生4-硝基苯酚的糖苷酶進行分子工程改造以得到比活力足夠高的酶作為一組標記酶，可使得同步分析ELISA成為一種可行的、新型的免疫分析平臺，該平臺不僅提高了分析效率，而且可獲得令人滿意的靈敏度。
　　4.標記酶篩選
　　我們通過以上兩組SDESA-ELISA應用實例得出以下結論，為獲得良好的檢測效果，SDESA-ELISA的一對顯色底物和一對標記酶的選擇需遵循以下

10、幾點原則:(a)一個顯色底物的最大等吸收波長應該等于或接近405 nm，其產物最大吸收峰在450 nm或490 nm附近，而另一個顯色底物的產物最大吸收峰應在405 nm附近，從而保證在最優(yōu)條件下用傳統(tǒng)光度計進行同步檢測時，任意一個顯色產物的定量靈敏度和LOQ都與各自單獨測定時相當。(b)一對合適的標記酶應該在相同的緩沖液中對一對預先選定的顯色底物具有足夠高的比活力，且耐受來自SDESA體系中物質的干擾，從而簡化數據處理過程。一般來說，