硫嘌呤甲基轉移酶的多態(tài)性及血液透析對其活性的影響.pdf

1、該課題研究了河南地區(qū)漢族人TPMT的多態(tài)性和部分等待腎移植的尿毒癥病人TPMT的基因型、表型及血液透析對TPMT活性的影響,以期為尿毒癥病人腎移植術后免疫抑制劑的個體化用藥提供臨床治療依據(jù).方法:1 TPMT基因型分析健康志愿者140例,互無親緣關系,河南地區(qū)漢族人,均為本校學生,男96例,女44例,平均年齡22.1±1.2歲,4個月內(nèi)無輸血史、疾病史、外傷史、服藥史;30例慢性尿毒癥患者,男性16例,女性14例,平均年齡32±9.6

2、5歲,采血前一個月未輸注紅細胞.SDS-蛋白酶K-酚-氯仿法提取基因組DNA,采用等位基因特異性的PCR(allele specific PCR,ASPCR)檢測TPMT<'*>1和TPMT<'*>2,限制性片段長度多態(tài)性-PCR(restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)分別檢測TPMT<'*>3A、TPMT<'*>3B和TPMT<'*>3C.2 TPMT表型分析 2.1 血標

3、本處理 在已確定TPMT基因型的健康志愿者中篩選30例,其中TPMT<'*>1型28例,TPMT<'*>3C型2例;30例尿毒癥患者均為TPMT<'*>1型.健康志愿者和尿毒癥患者血液透析前及透析后4小時各抽取肘靜脈血5ml,血樣置于肝素鋰管中抗凝后,6小時內(nèi)低溫離心分離紅細胞,生理鹽水洗滌兩遍,離心棄上清,紅細胞計數(shù)(用生理鹽水稀釋至4×10<'9>cells/ml),加入4倍冷蒸餾水裂解紅細胞,離心后取上層透明液,置于-20℃保存.

4、2.2 酶活性的測定 采用改良的高效液相色譜法測定紅細胞TPMT活性,用37℃每小時內(nèi)每毫升紅細胞催化生成1納摩爾6-MMP來表示TPMT酶的1個活性單位.取樣品解凍后,加入Chelex 100 4 ℃振蕩1h后離心,取上清.每1ml上清加入150μl(0.3M,pH 7.5)的磷酸鹽緩沖液,80μl別嘌呤醇(終濃度58μM),30μl二硫蘇糖醇(終濃度1090μM),20μl S-腺苷-L-蛋氨酸(S-adenosyl-Lmetion