視上核星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)急性腹腔高滲刺激引起的神經(jīng)元反應(yīng)的調(diào)節(jié)及其機(jī)制.pdf

1、為探索腹腔滲透壓感受器的信息傳至視上核（SON）和室旁核（PVN）之通路，信息通路各站（脊髓背角〈DHSC〉、延髓孤束核〈NTS〉和SON內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元對(duì)腹腔急性高滲刺激的反應(yīng)及其相互關(guān)系，星形膠質(zhì)細(xì)胞在滲透壓調(diào)節(jié)中的作用及調(diào)節(jié)機(jī)制，本研究進(jìn)行了下列四組實(shí)驗(yàn)。
　　實(shí)驗(yàn)一外周和中樞神經(jīng)元的軸突終末可直接終止于星形膠質(zhì)細(xì)胞
　　目的：觀察周圍神經(jīng)傳入纖維終末和中樞的傳入纖維終末是否直接終止于星形膠質(zhì)細(xì)胞。
　　方

2、法：10只健康成年雄性SD大鼠被分為2組：
　　第1組為迷走神經(jīng)切斷組，切斷左側(cè)頸部迷走神經(jīng)干，動(dòng)物成活30天。動(dòng)物按常規(guī)免疫電鏡制片方法進(jìn)行抗GFAP免疫電鏡染色。第2組為BDA順行示蹤組，將順行示蹤劑定位導(dǎo)入右側(cè)NTS內(nèi)，5天后常規(guī)灌流固定，恒冷箱制片，取延髓切片觀察BDA的注射區(qū)，2套SON切片分別進(jìn)行抗Vasopressin（VP）和抗GFAP的免疫熒光染色。Confocal顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。
　　結(jié)果：（1）電鏡下

3、在NTS內(nèi)觀察到正常的Synapses（包括對(duì)稱性和非對(duì)稱性Synapses）和軸突終末與GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞突起接觸形成
　　SynaptoidContacts。在迷走神經(jīng)切斷側(cè)NTS內(nèi)發(fā)現(xiàn)許多變性的軸突終末，它可單獨(dú)與神經(jīng)元（胞體或樹突）、GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞或同時(shí)與兩者接觸，形成SynaptoidContacts。
　?。?）BDA注射區(qū)局限于右側(cè)NTS，可見許多BDA標(biāo)記的胞體和密集的纖維。在SON發(fā)現(xiàn)4

4、0％的BDA標(biāo)記的纖維可與VP陽性神經(jīng)元接觸，36％的BDA標(biāo)記的纖維與GFAP陽性突起接觸。電鏡下也觀察到軸突終末與GFAP星形膠質(zhì)細(xì)胞形成SynaptoidContacts。
　　結(jié)論：星形膠質(zhì)細(xì)胞可直接與周圍神經(jīng)或中樞神經(jīng)的軸突終末接觸，形成SynaptoidContacts。
　　實(shí)驗(yàn)二迷走神經(jīng)至孤束核，孤束核至視上核的信息通路參與急性腹腔高滲刺激的調(diào)節(jié)
　　目的：探索腹腔滲透壓信息傳至SON和PVN的神經(jīng)通路

5、及相關(guān)部位星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元對(duì)急性腹腔高滲刺激的反應(yīng)。
　　方法：30只SD大鼠被分為6組（5只/組）：第1組為正常對(duì)照組，大鼠不作任何處理；第2組為等滲刺激組（IS組），向腹腔注入4ml0.15mol/L鹽水；第3組為高滲刺激組（HS組），注入4ml1.54mol/L鹽水；第4組為兩側(cè)膈下迷走神經(jīng)切斷加高滲刺激組（SDVplusHS組），在胃賁門處分離結(jié)扎并切斷兩側(cè)迷走神經(jīng)，7天后給予高滲刺激；第5組為兩側(cè)內(nèi)臟大神經(jīng)切斷加高滲

6、刺激組（SNLplusHS組），在腹后壁分離、結(jié)扎并切斷兩側(cè)內(nèi)臟大神經(jīng)，7天后給予高滲刺激，所有動(dòng)物常規(guī)固定，切斷前腦（含SON）、延髓（含NTS）和脊髓胸段；第6組為假手術(shù)加高滲刺激組。切片分別進(jìn)行各自的雙重免疫熒光反應(yīng)。
　　結(jié)果：（1）各組動(dòng)物脊髓胸段背角內(nèi)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元未見到明顯的反應(yīng)。
　　（2）HS組延髓NTS和最后區(qū)(AP)內(nèi)Fos陽性神經(jīng)元和GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯增加，與IS組的差異顯著，這種增

7、加可被SDV所阻止，但不能被SNL所抑制。
　?。?）HS組SON內(nèi)Fos陽性神經(jīng)元顯著增多，星形膠質(zhì)細(xì)胞由靜止型轉(zhuǎn)化為激活型，胞體變大，突起變粗，GFAP深染，平均熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，SON-VGL平均厚度增加，F(xiàn)os/GFAP雙標(biāo)細(xì)胞增多。SDV可阻止HS引起的反應(yīng)，SNL則不能。
　　結(jié)論：腹腔滲透壓感受器的信息是經(jīng)迷走神經(jīng)傳至NTS，由NTS發(fā)出的纖維至SON，不是經(jīng)內(nèi)臟大神經(jīng)傳導(dǎo)，脊髓背角不參與此信息的傳遞，而NTS可能

8、起著重要作用。
　　實(shí)驗(yàn)三急性腹腔高滲刺激后SON內(nèi)神經(jīng)元的反應(yīng)依賴于星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性
　　目的：觀察急性腹腔高滲刺激后SON星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的反應(yīng)及其相互關(guān)系。
　　方法：85只SD大鼠被分為5組：第1組正常對(duì)照組(n=5)處理；第2組為IS組(n=20)；第3組HS組（n=20）；第4組為氟代檸檬酸加高滲組（FCAplusHS組，n=20），預(yù)先向側(cè)腦室緩慢注入1nmol/1μ的FCA，2h后再給高滲刺激；第

9、5組為甘珀酸加高滲組（CBXplusHS組，n=20），預(yù)先向側(cè)腦室緩慢注入50μgCBX(10μg/μl,W/V)，2h后再給高滲刺激。以上動(dòng)物除第1組外，其余各組均分別成活15，45，90和180min，每一時(shí)間點(diǎn)5只。常規(guī)灌流固定、切片，SON切片進(jìn)行抗VP，抗Fos，抗Connexin43（Cx43），抗GFAP的單一或雙重免疫熒光染色。
　　結(jié)果：光鏡結(jié)果：（1）高滲刺激后SON星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)明顯，表現(xiàn)為細(xì)胞被激活，胞

10、體變大，突起變粗，GFAP深染，平均熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，SON-VGL厚度增厚，F(xiàn)os/GFAP雙標(biāo)細(xì)胞增加，Cx43表達(dá)明顯增加，以上反應(yīng)在刺激后45min達(dá)到高峰。（2）高滲刺激后SONMNCs也被激活，F(xiàn)os陽性胞核明顯增加，其高峰為90min。（3）FCA可明顯干擾星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元兩者的反應(yīng)，而CBX只抑制神經(jīng)元的反應(yīng)，不干擾星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)。
　　結(jié)論：高滲刺激后SON內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)敏感，在45min達(dá)到高峰，神經(jīng)元

11、的Fos表達(dá)90min為高峰。神經(jīng)元的活性依賴于星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性。
　　實(shí)驗(yàn)四腹腔急性高滲刺激后SON星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)Cx43hemichannel釋放谷氨酸調(diào)節(jié)神經(jīng)元的活性
　　目的：觀察高滲刺激后SON星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元的調(diào)節(jié)及其機(jī)制。
　　方法：（1）光鏡制片，25只SD雄性大鼠被分為5組（5只/組）：第1組為正常對(duì)照組；第2組為IS組；第3組為HS組；第4組為FCAplusHS組；第5組為CBXplusHS組

12、。所有動(dòng)物成活45min，常規(guī)固定、切片，切片進(jìn)行抗NMDAR-2，抗glutamate，抗GFAP，抗Cx43，抗Cx32，抗Fos，抗VP等單一，雙重或三重免疫熒光染色。
　?。?）星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)，取18天胎鼠的下丘腦，常規(guī)分離、純化培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞2周，將培養(yǎng)細(xì)胞分為4組：第1組為等滲DMEM培養(yǎng)組；第2組為高滲DMEM處理組；第3組先用CBX處理30min后再移至等滲DMEM；第4組先用CBX處理30min后再移至高滲D

13、MEM。各組均處理1，3，5，10和15min。
　?。?）分別收上述各組培養(yǎng)液用HPLC檢測(cè)Glutamate和Taurine的含量。
　?。?）電鏡制片，另有10只大鼠分為IS組（5只）和HS組（5只），進(jìn)行抗Cx43和抗NMDAR-2免疫電鏡染色。
　?。?）用3H放免測(cè)定檢測(cè)正常對(duì)照組，IS，HS，F(xiàn)CAplusHS，CBXplusHS，SDVplusHS，SNLplusHS各組血漿中VP的含量。
　　結(jié)

14、果：（1）腹腔高滲刺激后SON星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)glutamate表達(dá)明顯上調(diào)，F(xiàn)CA可干擾其上調(diào)，而CBX則不干擾。
　?。?）腹腔高滲刺激后SON神經(jīng)元上的NMDAR-2的表達(dá)明顯上調(diào)，F(xiàn)CA和CBX均可阻止其上調(diào)。
　?。?）腹腔高滲刺激后SON神經(jīng)元內(nèi)VP的表達(dá)上升，F(xiàn)CA，CBX，SDV均抑制VP的上升，但SNL不抑制。
　?。?）培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞高滲刺激后，胞內(nèi)glutamate的表達(dá)明顯上升，3min達(dá)到高

15、峰，以后下降。CBX加高滲刺激后glutamate的表達(dá)上升明顯，并一直維持在高位。
　?。?）HPLC檢測(cè)高滲刺激后培養(yǎng)液中g(shù)lutamate含量明顯上升，而?；撬岵簧仙?br>　?。?）腹腔高滲刺激SON內(nèi)Cx43hemichannels出現(xiàn)率明顯增加。
　　結(jié)論：腹腔高滲刺激激活SON星形膠質(zhì)細(xì)胞，被激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞增加合成glutamate，并通過Cx43hemichannels釋放，作用于神經(jīng)元上的NMDAR-