非致病性尖孢鐮刀菌CS-20誘導(dǎo)黃瓜抗枯萎病的分子機(jī)制研究.pdf

1、由致病性尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）侵染引起的枯萎病為毀滅性土傳病害，常造成嚴(yán)重減產(chǎn)甚至絕收。目前枯萎病的防治缺乏有效方法，如抗病品種和化學(xué)防治藥劑，因此研究生物技術(shù)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性成為防治作物枯萎病害的重要技術(shù)途徑。非致病性尖孢鐮刀菌株CS-20(Fusarium oxysporum CS-20)是從美國(guó)佛羅里達(dá)州的抑制西瓜枯萎病的土壤中分離而來，對(duì)作物枯萎病具有較好的防治效果，但是菌株CS-20誘導(dǎo)寄主植物產(chǎn)

2、生的防御反應(yīng)機(jī)制尚不明確，且菌株CS-20中哪些生防因子起作用以及它們誘導(dǎo)抗病的具體分子機(jī)理也未清楚，從而限制了菌株CS-20開發(fā)應(yīng)用。因此，本研究以黃瓜感病品種9930和菌株CS-20為研究對(duì)象，一方面解析菌株CS-20誘導(dǎo)黃瓜植株產(chǎn)生防御反應(yīng)機(jī)制;另一方面從菌株CS-20次生代謝物合成基因聚酮合成酶(polyketidebiosynthase，PKS)和非核糖體多肽合成酶(nonribosomal peptide synthetas

3、e，NRPS)中挖掘誘導(dǎo)抗病的關(guān)鍵效應(yīng)基因并闡明其具體功能。主要取得以下結(jié)果:
　　1.明確感病黃瓜品種9930在根部接種菌株CS-20后，黃瓜苗產(chǎn)生的抗病反應(yīng)機(jī)制。提前接種CS-20可誘導(dǎo)黃瓜苗產(chǎn)生抗病性，顯著降低黃瓜苗的病情指數(shù);熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)GFP(green fluorescent protein)標(biāo)記菌株CS-20只侵入和定殖在黃瓜苗主根和側(cè)根部表面，與黃瓜植株保持一個(gè)穩(wěn)定的互生關(guān)系;接種菌株CS-20可激活黃瓜苗根

4、部組織的水楊酸信號(hào)途徑、茉莉酸信號(hào)途徑和茉莉酸/乙烯信號(hào)途徑，且特異性地誘導(dǎo)鈣離子通道基因的上調(diào)表達(dá)。
　　2.基于菌株CS-20的全基因組測(cè)序結(jié)果，生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)到10個(gè)PKS基因，14個(gè)NRPS基因，3個(gè)PKS-NRPS雜合基因，3個(gè)DAMT(prenyltransferase)基因。qRT-PCR（quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction）分

5、析結(jié)果表明:菌株CS-20和致病菌FOC-BN分別接種黃瓜苗根部72h后，侵入根部的兩菌株中PKS-NRPS基因表達(dá)差異顯著。比較發(fā)現(xiàn):在菌株CS-20中有9個(gè)基因特異表達(dá)，其中4個(gè)基因(FOWE_10925、FOWE_10935、FOWE_01643、FOWE_09588)特異上調(diào)，5個(gè)基因特異下調(diào)(FOWE_00999、FOWE_12767、FOWE_03871、FOWE_06548和FOWE_11163)，推測(cè)它們可能與其誘導(dǎo)黃瓜

6、苗植株產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性相關(guān);在致病菌FOC-BN中15個(gè)基因特異上調(diào)表達(dá)，推測(cè)它們可能與其致病性相關(guān)。
　　3.采用Split marker gene deletion method方法對(duì)菌株CS-20的9個(gè)可能與誘導(dǎo)抗病性相關(guān)基因進(jìn)行敲除，結(jié)合PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化方法和潮霉素抗性篩選，并通過PCR和Southern bolt驗(yàn)證，獲得了9個(gè)與誘導(dǎo)抗病性相關(guān)基因缺失突變體(ΔFOWE_00999(T87)、ΔFOWE_127

7、67(T28)、ΔFOWE_03871(T19)、ΔFOWE_06548(T5)、ΔFOWE_10925(T17)、ΔFO WE_11163(T16)、ΔFOWE_10935(T13)、ΔFOWE_01643(T9)和ΔFOWE_09588(T20))。野生型菌株CS-20與突變體ΔFO WE_11163(T16)培養(yǎng)形態(tài)無明顯差異，而與其它8個(gè)候選效應(yīng)基因缺失突變體存在明顯差異;9個(gè)候選效應(yīng)基因缺失突變體和野生型菌株菌落生長(zhǎng)直徑每一天

8、都存在明顯差異(p＜0.05)，其中突變體ΔFOWE_10925(T17)和ΔFOWE_11163(T16)的生長(zhǎng)速率與野生型相當(dāng)，其它7個(gè)突變體的生長(zhǎng)速率則均小于野生型菌株的生長(zhǎng)速率。
　　4.采用挑戰(zhàn)接種和split-root接種方法分析9個(gè)候選基因缺失突變體在誘導(dǎo)抗病水平上差異，其中6個(gè)突變體（ΔFOWE_00999、ΔFOWE_12767、ΔFOWE_03871、ΔFOWE_06548、ΔFOWE_10925和ΔFOWE_

9、11163）接種后的病情指數(shù)顯著高于野生型菌株CS-20，推斷該6個(gè)候選效應(yīng)基因與誘導(dǎo)黃瓜苗產(chǎn)生抗病性密切相關(guān)，為菌株CS-20誘導(dǎo)抗病的關(guān)鍵效應(yīng)基因。相對(duì)于野生型菌株，6個(gè)關(guān)鍵效應(yīng)基因突變體處理后黃瓜苗根部和葉部的NPR1基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，與清水對(duì)照處理結(jié)果一致。在處理的黃瓜苗根部組織中，LOX1和 PAL1基因表達(dá)水平均顯著低于野生型菌株，但PR3基因表達(dá)只在突變體ΔFOWE_12767處理顯著降低;相對(duì)于根部組織，處理后葉部

10、組織中只有茉莉酸/乙烯信號(hào)途徑(PAL1)基因表達(dá)水平值差異較大，其它信號(hào)途徑基因的轉(zhuǎn)錄水平在6個(gè)效應(yīng)基因缺失突變體、野生型和清水處理之間整體上保持在一個(gè)水平曲線。
　　5.功能結(jié)構(gòu)域分析表明:誘導(dǎo)抗病的6個(gè)關(guān)鍵效應(yīng)基因均包含ketosynthase(KS)、acyl transferase(AT)、β-ketoreductase(KR)、dehydrogenase(DH)和enoyl reductase(ER),均屬于HR(hi

11、ghly reducing)-PKSs類型，合成產(chǎn)物為線性碳鏈或非芳香烴類化合物。基于各功能結(jié)構(gòu)域的蛋白序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明:6個(gè)關(guān)鍵效應(yīng)基因的各功能單元都各自處在一個(gè)小分支上，彼此之間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。
　　6.菌株CS-20的PKS-NRPS基因合成產(chǎn)物預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)6個(gè)關(guān)鍵效應(yīng)基因均未見合成產(chǎn)物報(bào)道。采用液質(zhì)聯(lián)用儀檢測(cè)了6個(gè)關(guān)鍵效應(yīng)基因缺失突變體和野生型菌株發(fā)酵產(chǎn)物粗提物的成分，進(jìn)一步差異比對(duì)和代謝物質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫分析，推測(cè)關(guān)鍵效

12、應(yīng)基因FOWE_00999可能合成產(chǎn)物為11，12，13-trihydroxy-9-octadecenoic acid，分子式為C18H34O5;關(guān)鍵效應(yīng)基因FOWE_12767可能合成產(chǎn)物為9，10，13-trihydroxy-11-octadecenoic acid(C18H34O5);關(guān)鍵效應(yīng)基因FOWE03871可能合成產(chǎn)物為5-hydroxy-2-octadecenoic acid，分子式為C18H34O3;關(guān)鍵效應(yīng)基因FOW

13、E_06548未找到線性類差異化合物;關(guān)鍵效應(yīng)基因FOWE10925可能合成產(chǎn)物為8-methoxy-13-hydroxy-9，11-octadecadienoic acid，分子式為C19H34O4;關(guān)鍵效應(yīng)基因FOWE11163可能合成產(chǎn)物為10-hydroxy-undecanoic acid，分子式為C11H22O3。所推測(cè)的5個(gè)化合物為未知新化合物，是否作為誘導(dǎo)子具有誘導(dǎo)抗病作用需進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　本研究首先明確菌株CS-