壓力調(diào)控BMSCs-PRF雙膜復(fù)合體修復(fù)兔TMJ髁突軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、顳頜關(guān)節(jié)(temporomandibularjoint,TMJ)是人體中最精細(xì)、也是承力最頻繁的關(guān)節(jié)之一。相應(yīng)地,在分散咀嚼壓力過(guò)程中發(fā)揮重要作用的髁突軟骨即成為關(guān)節(jié)系統(tǒng)中與力學(xué)刺激最密切的結(jié)構(gòu)之一。臨床上,由于炎癥、腫瘤、外傷和發(fā)育異常等多種原因造成的髁突軟骨缺損或退行性病變很常見(jiàn),而尋找軟骨缺損修復(fù)的方法一直是臨床的難題。在傳統(tǒng)的關(guān)節(jié)軟骨鉆孔、自體軟骨膜、骨膜移植和自體的骨軟骨移植都沒(méi)有取得良好效果的情況下,組織工程為關(guān)節(jié)軟骨損傷的

2、修復(fù)帶來(lái)了新的希望。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrowstemcells,BMSCs)是目前軟骨組織工程最理想的種子細(xì)胞。雖然針對(duì)大關(guān)節(jié)透明軟骨的大量實(shí)驗(yàn)都證明了BMSCs體外誘導(dǎo)性培養(yǎng)和體內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)均能有效地生成軟骨,但就目前的研究現(xiàn)狀來(lái)看,軟骨組織工程修復(fù)法并不十分完善,還存一些問(wèn)題需要解決:在種子細(xì)胞方面,BMSCs作為軟骨組織工程的種子細(xì)胞,常規(guī)的細(xì)胞懸液的接種方式存在接種效率低、細(xì)胞容易流失等缺點(diǎn),需要進(jìn)一步改進(jìn);支

3、架材料方面:目前應(yīng)用于軟骨組織工程的主要支架材料仍存在生物相容性較差,力學(xué)性能不足的缺點(diǎn);生長(zhǎng)因子方面則存在純化的生長(zhǎng)因子價(jià)格昂貴、難以獲得以及外源性的生長(zhǎng)因子常引起免疫排斥反應(yīng)等問(wèn)題。相關(guān)研究已表明,細(xì)胞膜片技術(shù)與富血小板纖維蛋白(platelet-richfibrin,PRF)的出現(xiàn)可以有效解決上述問(wèn)題,并且二者在修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損方面都有著很好的應(yīng)用前景。然而,可否將二者復(fù)合而成的雙膜復(fù)合體作為組織工程移植物植入到缺損區(qū)用于關(guān)節(jié)軟骨

4、缺損的修復(fù)尚需進(jìn)一步研究。到目前為止,組織工程軟骨尚止于組織形態(tài)及生化成分上與天然軟骨的類(lèi)似,而還難以實(shí)現(xiàn)與原有軟骨相同的功能性再生。要成功獲得關(guān)節(jié)軟骨的再生修復(fù),還需對(duì)種子細(xì)胞的生長(zhǎng)微環(huán)境進(jìn)行合理的體外模擬和體內(nèi)控制是目前軟骨組織工程研究領(lǐng)域的共識(shí)。有研究指出干細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)的微環(huán)境是由包括細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞因子在內(nèi)的基質(zhì)微環(huán)境和復(fù)雜的力學(xué)微環(huán)境共同組成的。還有研究報(bào)道干細(xì)胞比成體細(xì)胞有著更強(qiáng)的力學(xué)敏感性、生物力學(xué)信號(hào)對(duì)于調(diào)節(jié)干細(xì)胞的表

5、型分化十分重要。那么,力學(xué)刺激是否就是軟骨細(xì)胞表型分化和維持的關(guān)鍵外部刺激信號(hào)呢?力學(xué)環(huán)境的調(diào)控是否能有效地改變BMSCs修復(fù)軟骨缺損的效果呢?雖然目前有零星報(bào)道研究了單層BMSCs在力學(xué)信號(hào)刺激下的生物效應(yīng)以及信號(hào)機(jī)制,但由于這些細(xì)胞力學(xué)模型中的BMSCs都缺乏基質(zhì)保護(hù)、細(xì)胞因子支持、甚至力學(xué)刺激與細(xì)胞因子的“對(duì)話”,而且所施加力學(xué)刺激條件與真實(shí)關(guān)節(jié)軟骨在體的承力狀況也相差較大,其研究結(jié)果并不能很好地模擬和詮釋在體功能狀態(tài)下BMSCs

6、用于髁突軟骨再生時(shí)的生物學(xué)特點(diǎn)和信號(hào)機(jī)理。因此本研究擬以采用膜片化的BMSCs,復(fù)合富含多種內(nèi)源性生長(zhǎng)因子的PRF,構(gòu)建BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體的基質(zhì)復(fù)合體以模擬關(guān)節(jié)軟骨在體基質(zhì)微環(huán)境;并將BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體經(jīng)體外壓力微環(huán)境預(yù)調(diào)后,與軟骨碎塊混合用于裸鼠皮下移植以觀察其異位成軟骨能力、在兔髁突軟骨缺損區(qū)移植以確定其對(duì)缺損關(guān)節(jié)軟骨的原位在體修復(fù)情況,從而揭示壓力調(diào)控是否可為組織工程關(guān)節(jié)軟骨的體內(nèi)外構(gòu)建與功能性再生提供新的思路

7、、為髁突軟骨缺損性疾病的治療提供新的契機(jī),乃至為多種關(guān)節(jié)軟骨缺損的體外組織工程設(shè)計(jì)提供研究經(jīng)驗(yàn)。課題主要分為以下三部分:
　　一、兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)及鑒定
　　目的:利用密度梯度離心法聯(lián)合貼壁篩選法分離、培養(yǎng)及純化兔BMSCs,并對(duì)培養(yǎng)的BMSCs進(jìn)行鑒定。方法:骨髓穿刺法抽取新西蘭兔股骨骨髓3ml,采用密度梯度離心法分離BMSCs并進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng);再對(duì)培養(yǎng)至第三代的BMSCs進(jìn)行成骨、成脂能力觀察,以及細(xì)胞表

8、面標(biāo)志物的鑒定。結(jié)果:培養(yǎng)的兔BMSCs可在體外迅速擴(kuò)增,其形態(tài)特征與生長(zhǎng)規(guī)律符合典型BMSCs的特點(diǎn);可成功向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞方向分化;細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29、CD44呈陽(yáng)性表達(dá),CD34、CD45呈陰性表達(dá)。結(jié)論:在體外采用密度梯度離心法聯(lián)合貼壁培養(yǎng)法可成功獲得高純度、具有多向分化潛能的兔BMSCs。
　　二、壓力調(diào)控BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體異位成軟骨的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:觀察經(jīng)壓力調(diào)控后的BMSCs/PRF雙膜復(fù)

9、合體在軟骨微環(huán)境下異位成軟骨的情況。方法:抽取兔耳中央動(dòng)脈血制備PRF后,按照本課題組前期探索并已申請(qǐng)的國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利:一種干細(xì)胞膜片片段復(fù)合富血小板纖維蛋白膜雙膜復(fù)合體移植材料的制備方法,將自體BMSCs膜片與自體PRF復(fù)合形成BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體,再根據(jù)本課題組前期篩選出的對(duì)體外培養(yǎng)BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體產(chǎn)生良好促軟骨向分化效應(yīng)的生物力學(xué)刺激條件:120KPa每天1h、連續(xù)4天靜態(tài)液壓進(jìn)行加載。45只4周齡BALB/C裸

10、鼠隨機(jī)分為3組(n=15):單獨(dú)細(xì)胞膜片組(A組)在背部?jī)蓚?cè)植入BMSCs膜片片段與兔耳軟骨碎塊的復(fù)合物;雙膜復(fù)合體組(B組)背部?jī)蓚?cè)植入BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體與軟骨碎塊的復(fù)合物;雙膜復(fù)合體加壓組(C組)則植入120KPa每天1h、連續(xù)4天壓力刺激預(yù)調(diào)的BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體與軟骨碎塊的復(fù)合物。分別于術(shù)后2、4、8周取材,進(jìn)行HE與甲苯胺藍(lán)染色觀察,并運(yùn)用IPP6.0軟件對(duì)各組甲苯胺藍(lán)染色圖片進(jìn)行著色強(qiáng)度分析,所得結(jié)果用SP

11、SS13.0軟件統(tǒng)計(jì)處理。結(jié)果:HE染色顯示,B組與C組2、4、8周均可見(jiàn)軟骨細(xì)胞生成,并且C組在各時(shí)間點(diǎn)軟骨細(xì)胞生成量要多于同時(shí)間點(diǎn)的其它組;甲苯胺藍(lán)染色顯示,B組與C組2、4、8周平均OD值呈逐漸增加趨勢(shì),并顯著高于同時(shí)間點(diǎn)的A組(P<0.05),而且C組在4周與8周平均OD值顯著高于同時(shí)間點(diǎn)的B組(P<0.05)。結(jié)論:經(jīng)壓力調(diào)控后的BMSCs/PPF雙膜復(fù)合體與未經(jīng)壓力預(yù)調(diào)的雙膜復(fù)合體相比,在軟骨微環(huán)境中具有更強(qiáng)的成軟骨能力;而

12、沒(méi)有PRF生長(zhǎng)因子微環(huán)境支持且缺乏生物力學(xué)預(yù)調(diào)的單純BMSCs膜片即便在軟骨微環(huán)境中,其成軟骨能力遠(yuǎn)不及上述兩組。
　　三、壓力調(diào)控BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體修復(fù)兔髁突軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:探討經(jīng)壓力調(diào)控后的BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體修復(fù)兔髁突軟骨缺損的可行性。方法:制備自體來(lái)源的BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體,其中BMSCs經(jīng)BrdU預(yù)先標(biāo)記。以120KPa每天1h、連續(xù)4天靜態(tài)液壓加載。取3-4月齡新西蘭兔45

13、只,隨機(jī)分為5組(n=9),首先建立兔雙側(cè)髁突軟骨缺損的模型,再分別進(jìn)行以下處理:空白對(duì)照組(A組)缺損區(qū)不作任何處理;單獨(dú)PRF組(B組)在缺損區(qū)植入自體PRF膜片顆粒;單獨(dú)細(xì)胞膜片組(C組)缺損區(qū)植入自體BMSCs膜片片段;雙膜復(fù)合體組(D組)缺損區(qū)植入自體BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體;雙膜復(fù)合體加壓組(E組)在缺損區(qū)植入壓力處理過(guò)的自體BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體。分別于術(shù)后2、4、8周取材,進(jìn)行大體觀察與HE、甲苯胺藍(lán)染色以及B

14、rdU免疫組化染色,并運(yùn)用IPP6.0軟件對(duì)各組甲苯胺藍(lán)染色圖片進(jìn)行著色強(qiáng)度分析,所得結(jié)果用SPSS13.0軟件統(tǒng)計(jì)處理。結(jié)果:大體形態(tài)學(xué)觀察,采用120KPa每天1h、連續(xù)4天靜態(tài)液壓預(yù)調(diào)的BMSCs/PRF修復(fù)組(E組)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)修復(fù)情況要明顯好于同時(shí)間點(diǎn)的其它組,8周時(shí)該組的髁突軟骨缺損區(qū)已被完全修復(fù),修復(fù)組織色澤、質(zhì)地與正常軟骨基本一致,與周?chē)浌墙缇€不清。HE染色也證實(shí)該組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的修復(fù)效果都是四種處理中最好的,8周時(shí)損

15、傷區(qū)已基本被修復(fù),修復(fù)組織表層為較致密的纖維組織,較正常纖維層稍厚,其下方軟骨層層次清晰,與鄰近正常軟骨的各層基本連續(xù)。甲苯胺藍(lán)染色顯示,除空白對(duì)照組(A組)外,其余四組的甲苯胺藍(lán)染色強(qiáng)度在2、4、8周隨時(shí)間延長(zhǎng)均呈逐漸增加趨勢(shì),以E組8周時(shí)的平均OD值最高(P<0.05)。BrdU染色結(jié)果證實(shí),修復(fù)組織主要來(lái)源于術(shù)中植入的BMSCs;且在同一時(shí)間點(diǎn),D組和E組新生軟骨組織中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)要多于C組。結(jié)論:經(jīng)120KPa每天1h、連續(xù)4天靜

16、態(tài)液壓預(yù)調(diào)后的BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體可成功修復(fù)兔TMJ髁突軟骨缺損。
　　小結(jié):本課題首次采用BMSCs膜片復(fù)合PRF膜的雙膜復(fù)合體,構(gòu)建用于髁突軟骨缺損修復(fù)的組織工程移植物。并采用可控細(xì)胞液壓加載系統(tǒng)模擬TMJ髁突軟骨所處的力學(xué)微環(huán)境,根據(jù)前期研究中所篩選的對(duì)BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體最適的壓力條件,對(duì)BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體進(jìn)行壓力微環(huán)境預(yù)調(diào),進(jìn)一步探究生物力學(xué)微環(huán)境對(duì)組織工程軟骨形成質(zhì)與量的影響以及對(duì)兔髁突軟骨缺