NF-κB信號分子在壓力預(yù)調(diào)促BMSCs-PRF雙膜結(jié)構(gòu)修復(fù)兔髁突軟骨缺損中作用的研究.pdf

1、關(guān)節(jié)軟骨在關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮減小摩擦、緩沖震動(dòng)的作用，關(guān)節(jié)軟骨被破壞，不能發(fā)揮正常功能，是各類關(guān)節(jié)疾病的主要病因。如何修復(fù)缺損軟骨、恢復(fù)軟骨功能，是各類關(guān)節(jié)疾病治療的重點(diǎn)。現(xiàn)行的有關(guān)軟骨缺損修復(fù)方法主要有自體異體軟骨移植、髁突關(guān)節(jié)置換、組織工程軟骨技術(shù)等方法，其中以組織工程軟骨技術(shù)最具前景。
　　組織工程技術(shù)是選用合適的種子細(xì)胞，結(jié)合對應(yīng)的支架材料，在一定生長因子的作用下，并給予合適的生物微環(huán)境，促使種子細(xì)胞在支架材料中形成相應(yīng)的組織

2、?，F(xiàn)行組織工程軟骨技術(shù)選用的種子細(xì)胞主要有軟骨細(xì)胞和干細(xì)胞兩類，而軟骨細(xì)胞因來源有限，其在臨床應(yīng)用受到了限制；干細(xì)胞來源廣泛，尤其是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，取材方便，增殖能力強(qiáng)，在組織工程軟骨的研究中應(yīng)用比較廣泛。富血小板纖維蛋白是近年來出現(xiàn)的血漿提取物，其富含各種生長因子，同時(shí)自體富血小板纖維蛋白克服了其他支架材料生物相容性差的問題，在臨床和科研的應(yīng)用中具有無可比擬的優(yōu)勢。
　　本課題組在前期研究中針對組織工程軟骨技術(shù)進(jìn)行了大量的研究

3、，我們選擇骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrowmesenchymalstem cells，BMSCs）作為種子細(xì)胞，富血小板纖維蛋白（Platelet-rich fibrin，PRF）作為支架材料，構(gòu)建BMSCs/PRF雙膜結(jié)構(gòu)并成功在體外合成了軟骨，同時(shí)為模擬軟骨在體內(nèi)的受力環(huán)境，我們自行研制了一種新型細(xì)胞壓力加載系統(tǒng)，通過在體外給予BMSCs/PRF雙膜結(jié)構(gòu)一定壓力刺激，我們發(fā)現(xiàn)，壓力對BMSCs/PRF雙膜結(jié)構(gòu)合成軟骨有促進(jìn)作

4、用。同時(shí)，在體外對壓力促進(jìn)雙膜結(jié)構(gòu)合成軟骨機(jī)制的相關(guān)研究中，我們發(fā)現(xiàn)NF-κB信號通路發(fā)揮著重要的作用，但在體內(nèi)軟骨缺損的修復(fù)過程中是否發(fā)揮作用，還有待于進(jìn)一步研究。再者，組織工程軟骨應(yīng)用種子細(xì)胞和支架材料合成的軟骨與正常軟骨的生物力學(xué)性能之間存在差異，常導(dǎo)致移植物與缺損區(qū)接觸面的應(yīng)力集中，影響組織工程軟骨功能的發(fā)揮。缺損區(qū)新生軟骨必須具有正常軟骨的生物力學(xué)性能，才能更好的發(fā)揮功能。BMSCs/PRF雙膜結(jié)構(gòu)在體內(nèi)軟骨缺損區(qū)形成的新生軟

5、骨，其生物力學(xué)特性如何，與正常軟骨是否存在差異，對缺損區(qū)軟骨修復(fù)很有意義，直接決定著新生軟骨功能的發(fā)揮。
　　本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建動(dòng)物體內(nèi)軟骨缺損模型，用壓力預(yù)調(diào)BMSCs/PRF雙膜結(jié)構(gòu)填充缺損區(qū)，用NF-κB抑制劑PDTC阻斷雙膜結(jié)構(gòu)中NF-κB信號通路，通過觀察缺損區(qū)軟骨修復(fù)情況及NF-κB信號分子和相關(guān)成軟骨基因的表達(dá)，探討NF-κB信號通路在體內(nèi)壓力促進(jìn)BMSCs/PRF雙膜結(jié)構(gòu)修復(fù)軟骨缺損中的作用。本實(shí)驗(yàn)還通過檢測缺損區(qū)新生

6、軟骨的彈性模量，對比新生軟骨和正常軟骨彈性模量的差異，評價(jià)新生軟骨的生物力學(xué)特性恢復(fù)情況。
　　實(shí)驗(yàn)分為三部分：
　　實(shí)驗(yàn)一：通過抽取兔骨髓，分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)成骨成脂誘導(dǎo)及表面標(biāo)志物鑒定，證明我們分離培養(yǎng)的細(xì)胞是間充質(zhì)來源的干細(xì)胞，并通過抽取兔耳緣動(dòng)脈血，制作PRF膜片，成功構(gòu)建了BMSCs/PRF雙膜結(jié)構(gòu)。對NF-κB信號通路抑制劑PDTC進(jìn)行濃度篩選，證明20μmol/L的PDTC既能有效阻斷信號通路，又能保

7、持細(xì)胞膜片的活性。通過構(gòu)建兔髁突軟骨缺損動(dòng)物模型，用BMSCs/PRF雙膜結(jié)構(gòu)（經(jīng)壓力預(yù)調(diào)或NF-κB信號通路抑制劑PDTC處理）填充缺損區(qū)，經(jīng)切片染色，觀察缺損區(qū)修復(fù)效果，評價(jià)NF-κB信號通路在雙膜結(jié)構(gòu)體內(nèi)成軟骨中的作用。常規(guī)HE染色結(jié)果顯示：壓力預(yù)調(diào)的雙膜結(jié)構(gòu)填充組修復(fù)效果優(yōu)于未經(jīng)壓力預(yù)調(diào)的雙膜結(jié)構(gòu)填充組，前者又以填充后8周時(shí)的軟骨再生修復(fù)效果最好，接近于假手術(shù)組；NF-κB抑制劑預(yù)處理后，雙膜結(jié)構(gòu)填充組和壓力預(yù)調(diào)的雙膜結(jié)構(gòu)填充組

8、修復(fù)效果均明顯降低，且兩者之間沒有明顯差異。甲苯胺藍(lán)染色、番紅O快綠染色則從軟骨細(xì)胞數(shù)量、軟骨基質(zhì)合成等角度，評價(jià)缺損修復(fù)效果，其結(jié)果與HE染色結(jié)果一致。組織學(xué)觀察結(jié)果證明了對種子細(xì)胞的壓力預(yù)調(diào)能夠促進(jìn)雙膜結(jié)構(gòu)修復(fù)軟骨缺損，而阻斷NF-κB信號通路以后，壓力預(yù)調(diào)對雙膜結(jié)構(gòu)修復(fù)缺損的輔助增強(qiáng)效果則明顯降低。實(shí)驗(yàn)二：通過Western Blotting和PCR檢測缺損區(qū)NF-κB信號分子I-κB和P-65及相關(guān)成軟骨基因Aggrecan、S

9、ox-9、Col-ll。結(jié)果顯示：經(jīng)加壓處理的雙膜結(jié)構(gòu)填充組，I-κB和P-65磷酸化水平及基因表達(dá)量高于未經(jīng)加壓處理的雙膜結(jié)構(gòu)填充組；經(jīng)PDTC處理后，壓力預(yù)調(diào)雙膜結(jié)構(gòu)組和單純雙膜結(jié)構(gòu)組在缺損區(qū)I-κB和P-65的磷酸化水平及基因表達(dá)量明顯降低且兩組間未見明顯差異。Western Blotting和PCR檢測缺損區(qū)軟骨基因Aggrecan、Sox-9基因表達(dá)量在各組間的變化趨勢與NF-κB信號分子變化趨勢相似：壓力預(yù)處理雙膜結(jié)構(gòu)組和單

10、純雙膜結(jié)構(gòu)組的成軟骨基因表達(dá)量明顯高于對照，其中前者又顯著高于后者；經(jīng)PDTC阻斷NF-κB信號通路后，單純雙膜結(jié)構(gòu)移植組與靜壓力預(yù)處理的雙膜結(jié)構(gòu)移植組的再生軟骨形成量均較未經(jīng) PDTC處理的組明顯降低。Western Blotting和PCR檢測結(jié)果從分子生物學(xué)角度證明了壓力預(yù)調(diào)能夠促進(jìn)雙膜結(jié)構(gòu)體內(nèi)合成軟骨，同時(shí)NF-κB在壓力促進(jìn)雙膜結(jié)構(gòu)體內(nèi)合成軟骨的過程中發(fā)揮著重要的作用。
　　實(shí)驗(yàn)三：通過力學(xué)加載測試系統(tǒng)，對比分析缺損區(qū)新

11、生軟骨的生物力學(xué)特性。我們通過以恒定移動(dòng)速度在新生軟骨區(qū)加壓，檢測記錄壓頭在移動(dòng)中的受力，通過計(jì)算統(tǒng)計(jì)，繪制每組標(biāo)本的應(yīng)力-應(yīng)變曲線，計(jì)算出每組標(biāo)本的彈性模量，通過對比各組標(biāo)本的不同彈性模量，評價(jià)各組再生軟骨的生物力學(xué)特性。結(jié)果顯示，隨著時(shí)間延長，各組標(biāo)本彈性模量均呈上升趨勢；壓力預(yù)調(diào)雙膜結(jié)構(gòu)組在8周時(shí)，與正常軟骨彈性模量最接近；壓力預(yù)處理組彈性模量高于未經(jīng)壓力預(yù)處理的單純雙膜結(jié)構(gòu)組，NF-κB抑制劑干預(yù)后，各組再生軟骨的彈性模量明顯降

12、低，以壓力預(yù)調(diào)雙膜結(jié)構(gòu)組下降最明顯。
　　從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知：對比壓力預(yù)調(diào)雙膜結(jié)構(gòu)填充組和單純雙膜結(jié)構(gòu)填充組，壓力預(yù)調(diào)雙膜結(jié)構(gòu)組修復(fù)效果明顯好于單純雙膜結(jié)構(gòu)組，說明壓力對雙膜結(jié)構(gòu)體內(nèi)成軟骨作用具有促進(jìn)作用；對比雙膜結(jié)構(gòu)填充組和NF-κB抑制劑預(yù)處理雙膜結(jié)構(gòu)填充組，前者的軟骨缺損修復(fù)效果明顯好于后者，說明NF-κB信號通路參與了體內(nèi)雙膜結(jié)構(gòu)促軟骨再生修復(fù)的作用；對比壓力預(yù)調(diào)雙膜結(jié)構(gòu)填充組和抑制劑預(yù)處理加壓力預(yù)調(diào)雙膜結(jié)構(gòu)填充組可知，經(jīng)

13、PDTC阻斷NF-κB信號通路后，壓力的促軟骨再生效應(yīng)受到明顯的抑制，說明壓力預(yù)調(diào)促進(jìn)BMSCs/PRF雙膜結(jié)構(gòu)再生修復(fù)缺損軟骨的過程中，NF-κB信號通路發(fā)揮著重要的作用。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論：
　　1、BMSCs/PRF所構(gòu)建的雙膜結(jié)構(gòu)是一種理想的髁突軟骨缺損的組織工程移植物，NF-κB信號通路參與了體內(nèi)基于BMSCs/PRF雙膜結(jié)構(gòu)的軟骨再生修復(fù)過程。
　　2、壓力預(yù)調(diào)對基于BMSCs/PRF雙膜結(jié)構(gòu)的髁突軟骨缺損再生