版權(quán)說(shuō)明:本文檔由用戶(hù)提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡(jiǎn)介
1、目的: 軟骨損傷是骨科的較為常見(jiàn)的疾患,至今軟骨缺損的修復(fù)仍無(wú)理想的辦法。創(chuàng)傷、骨軟骨炎、骨性關(guān)節(jié)炎、髕骨軟化等均可引起軟骨以及軟骨下骨的損傷和/或缺損。軟骨損傷的修復(fù)一直是關(guān)節(jié)外科的一個(gè)難題,本課題研究的目的是采用組織工程技術(shù),體外分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs),經(jīng)過(guò)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)生成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞后,將軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞接種到三維多孔β-磷酸三鈣(β-TCP)陶瓷支架材料上置于生物反應(yīng)器中復(fù)合培養(yǎng),構(gòu)建骨軟骨復(fù)合體,觀察
2、細(xì)胞在支架材料上的黏附、伸展和增殖情況,并模仿馬賽克骨軟骨移植術(shù)用塑型良好的骨軟骨復(fù)合體修復(fù)動(dòng)物軟骨缺損,觀察其修復(fù)情況,探討以β-TCP為載體建造組織工程化軟骨修復(fù)骨軟骨缺損的可行性。 材料和方法 1.取10-12月齡健康比格犬3只,無(wú)菌穿刺抽取髂骨骨髓7-8ml,Percoll分離法分離骨髓聞充質(zhì)干細(xì)胞,進(jìn)行原代、傳代細(xì)胞培養(yǎng)。流式細(xì)胞儀鑒定。取第3代的MSCs,根據(jù)滴加生長(zhǎng)因子的不同,分為三組:I組軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)組,
3、滴加軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)液(組成:轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β110ng/L,胰島素10u/L,地塞米松100nmol/L);Ⅱ組成骨細(xì)胞誘導(dǎo)組,滴加成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液(組成;地塞米松10nmol/L,β-甘油磷酸鈉10mmol/L,維生素C50mg/L);Ⅲ組空白對(duì)照組,未滴加任何誘導(dǎo)因子。三組中常規(guī)加入含10%胎牛血清的DMEM液。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況,誘導(dǎo)培養(yǎng)14天后,軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)組行MTT法觀察細(xì)胞增殖狀況,細(xì)胞培養(yǎng)上清液檢測(cè)糖胺聚糖的含量,免
4、疫組化檢測(cè)誘導(dǎo)細(xì)胞Ⅱ型膠原的分泌,以觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的情況;成骨細(xì)胞誘導(dǎo)組行堿性磷酸酶染色和礦化結(jié)節(jié)染色以觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的情況。 2.取經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)14天的MSCs,經(jīng)檢驗(yàn)誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞后,分別調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/ml,與β-磷酸三鈣(β-TCP)復(fù)合培養(yǎng)1天,置入生物反應(yīng)器中培養(yǎng)21天,進(jìn)行復(fù)合組織的病理形態(tài)學(xué)觀察;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)備用。β-磷酸三鈣(β-TCP)及軟骨細(xì)胞一成骨細(xì)
5、胞-β-磷酸三鈣支架復(fù)合體進(jìn)行掃描電鏡觀察。以觀察β-TCP支架材料的結(jié)構(gòu)、孔隙率;觀察軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞在β-磷酸三鈣支架內(nèi)黏附和生長(zhǎng)增殖情況。 3.取10-12月齡健康比格犬10只,在實(shí)驗(yàn)犬的股骨滑車(chē)處鉆直徑5mm,深度5mm的骨軟骨缺損,深達(dá)軟骨下區(qū)。隨機(jī)分為3組:A組,作為實(shí)驗(yàn)組,10只,左膝軟骨缺損處深層植入軟骨細(xì)胞-成骨細(xì)胞-β-磷酸三鈣復(fù)合體:B組,作為陰性對(duì)照組,10只,左膝軟骨缺損處植入軟骨細(xì)胞-β-磷酸三鈣復(fù)
6、合體;C組,空白對(duì)照組,10只,左膝軟骨缺損處植入空β-磷酸三鈣。分別于術(shù)后12、16周處死取材,進(jìn)行大體和組織學(xué)觀察。 結(jié)果: 1.細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變倒置相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),原代細(xì)胞接種后1-3日可見(jiàn)少量細(xì)胞貼壁,呈短梭形。3日后出現(xiàn)細(xì)胞集落,7-8日廣泛集落形成。12-14日細(xì)胞形成單層。傳代細(xì)胞貼壁快,7-8日形成單層,細(xì)胞核大,胞漿內(nèi)顆粒多。加入細(xì)胞因子后,細(xì)胞生長(zhǎng)明顯加快,呈漩渦狀生長(zhǎng)。 2.入細(xì)胞因子TG
7、Fβ1(Ⅰ組)的MTT吸光度值、培養(yǎng)上清液中的糖胺聚糖(GAG)含量和Ⅱ型膠原分泌均明顯高于對(duì)照組(Ⅲ組)。Ⅱ型膠原免疫組化陽(yáng)性的MSCs胞漿染色為黃色或棕黃色。堿性磷酸酶(ALP)染色顯示成骨細(xì)胞胞質(zhì)中陽(yáng)性反應(yīng)呈現(xiàn)灰黑色顆粒或塊狀沉淀;礦化結(jié)節(jié)染色表明成骨細(xì)胞可形成肉眼可見(jiàn)的自色礦化結(jié)節(jié),常用茜素紅法染色,染料品種的不同,礦化結(jié)節(jié)呈顯不同的紅色。 3.電鏡觀察:掃描電鏡顯示β-磷酸三鈣(β-TCP)材料平均孔徑為400~600
8、inn,孔隙率為75%±10%,氣孔溝通率達(dá)100%。復(fù)合材料顯示軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞在β-磷酸三鈣(β-TCP)支架上的黏附、伸展和增殖良好,可以見(jiàn)到細(xì)胞分泌的基質(zhì)和細(xì)胞偽足的鉚固作用,表明支架材料具有良好的細(xì)胞親和性。 4動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果大體觀察:術(shù)后16周,實(shí)驗(yàn)組缺損修復(fù)區(qū)組織與周?chē)P(guān)節(jié)軟骨相整合,軟骨缺損區(qū)被光滑白色半透明的組織覆蓋,與周?chē)浌墙M織外形無(wú)差異;陰性對(duì)照組缺損區(qū)修復(fù)組織與周?chē)浌遣糠终显谝黄?,光澤較差;空白對(duì)照
9、組缺損處修復(fù)組織低凹,新生組織軟,無(wú)光澤,與周?chē)浌墙M織區(qū)別明顯。組織學(xué)觀察:術(shù)后16周,實(shí)驗(yàn)組缺損區(qū)軟骨厚度與正常軟骨組織接近,細(xì)胞排列出現(xiàn)明顯規(guī)律,表面層的軟骨細(xì)胞平行關(guān)節(jié)面排列,深層縱向排列,與透明軟骨組織相似,軟骨下骨形成,潮線基本恢復(fù),與周?chē)\浌沁B接較好。陰性對(duì)照組軟骨細(xì)胞排列不規(guī)則,中央修復(fù)區(qū)大部分為纖維組織修復(fù)??瞻讓?duì)照組缺損區(qū)內(nèi)主要為纖維組織。 結(jié)論: 1.MSCs適合成為軟骨組織工程的種子細(xì)胞。取材
10、方便,Pereoll分離法分離可以獲取大量骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,體外培養(yǎng)性能穩(wěn)定,易于傳代擴(kuò)增,在一定誘導(dǎo)條件的培養(yǎng)下,可以分化為軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞。 2.TGF-β1在促進(jìn)MSCs細(xì)胞增殖和向軟骨細(xì)胞定向分化方面有顯著的作用,均明顯高于對(duì)照組。 3.β-磷酸三鈣(β-TCP)支架是理想的軟骨組織工程支架材料。具有良好的孔隙率和組織相容性,軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞在其中可以很好地黏附、擴(kuò)展和增殖。 4 MSCs經(jīng)向軟骨細(xì)胞
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無(wú)特殊說(shuō)明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶(hù)所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒(méi)有圖紙預(yù)覽就沒(méi)有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫(kù)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶(hù)上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶(hù)上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶(hù)因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 應(yīng)用生物反應(yīng)器及體外微團(tuán)培養(yǎng)構(gòu)建骨軟骨復(fù)合體修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf
- 體外培養(yǎng)骨軟骨復(fù)合組織修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究.pdf
- 應(yīng)用旋壁生物反應(yīng)器體外培養(yǎng)兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞.pdf
- 體內(nèi)構(gòu)建骨軟骨復(fù)合體修復(fù)骨軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf
- 滾壓載荷生物反應(yīng)器促進(jìn)兔軟骨細(xì)胞-絲素蛋白多孔支架復(fù)合體生成功能化關(guān)節(jié)軟骨的研究.pdf
- 自體骨復(fù)合纖維蛋白凝膠負(fù)載軟骨細(xì)胞修復(fù)關(guān)節(jié)骨軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf
- BMSCs與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)復(fù)合BMG修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf
- 骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)加載體復(fù)合移植修復(fù)關(guān)節(jié)骨軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf
- 自體軟骨鑲嵌移植修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf
- 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷.pdf
- 小腸粘膜下層材料復(fù)合體修復(fù)大塊關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf
- 組織工程方法修復(fù)關(guān)節(jié)骨軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf
- 應(yīng)用旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器體外構(gòu)建組織工程軟骨的實(shí)驗(yàn)研究.pdf
- 三維培養(yǎng)兔自體關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf
- 低溫防護(hù)處理的異體骨軟骨移植修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的研究.pdf
- 骨髓基質(zhì)細(xì)胞-脫細(xì)胞骨基質(zhì)-bFGF復(fù)合體修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf
- 組織工程軟骨的構(gòu)建及修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf
- 折疊式骨膜-骨復(fù)合組織游離移植修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究
- 兔OA骨-軟骨復(fù)合體的相關(guān)研究.pdf
- 膠原復(fù)合梯度磷酸三鈣修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf
評(píng)論
0/150
提交評(píng)論