擬南芥和水稻非特異脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白的分子進化、表達模式以及在花藥發(fā)育中的功能分析RCHY1與CSA互作的功能機理初步探討.pdf

1、（一）擬南芥和水稻非特異脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白的分子進化、表達模式以及在花藥發(fā)育中的功能分析
　　植物非特異脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白(non-specific lipid transfer proteins，nsLTPs)是一類小分子堿性蛋白，該蛋白家族在植物的角質(zhì)蠟質(zhì)形成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及生殖發(fā)育等方面發(fā)揮了重要的功能。盡管目前通過正向遺傳學(xué)的方法，已經(jīng)克隆出幾十個植物nsLTPs基因并對它們的功能有了初步探討，但在系統(tǒng)對比研究擬南芥和水稻中nsLTPs

2、的分子進化、基因表達和功能預(yù)測方面仍很欠缺。
　　本研究從生物信息學(xué)的角度出發(fā)，嘗試利用生物信息學(xué)的方法，通過對比分析45個擬南芥和49個水稻nsLTPs基因的亞家族分類、基因復(fù)制、蛋白結(jié)構(gòu)、表達模式和功能預(yù)測等信息，圍繞擬南芥和水稻nsLTPs可能的分子進化、蛋白功能和表達分布的異同展開探討，初步闡明nsLTPs基因家族在單雙子葉中可能存在的進化、表達模式和功能上的差異。同時以花藥發(fā)育過程為例，細致分析和推測花藥發(fā)育中的不同亞家

3、族nsLTPs基因在生殖發(fā)育過程中不同時期的生物學(xué)功能，主要研究結(jié)果表明：
　　1）從蛋白結(jié)構(gòu)上來看，不同物種在不同環(huán)境中進化上的差異，造成了不同的nsLTPs亞家族；擬南芥的nsLTPs基因更多的定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，可能更多的參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成的疏水化合物的運輸，而與之相對的是水稻中的nsLTPs分布更為廣泛--從細胞核到細胞質(zhì)都有分布，推測對于整個細胞內(nèi)部的物質(zhì)運輸都起到重要作用。
　　2）從擬南芥和水稻的nsLTPs家族基因的

4、染色體分布可以看出，部分的家族成員在染色體上以基因簇的方式呈現(xiàn)，特別是一些基因有緊密連鎖的關(guān)系，這說明在nsLTPs家族基因進化的過程中可能由同一片段起源，而且發(fā)生了多拷貝復(fù)制。
　　3）nsLTPs的GO功能分析表明，在生物學(xué)過程中nsLTPs主要參與水稻中從定位到運輸這個整體過程，可以看出其功能十分完備，而擬南芥中的nsLTPs的富集數(shù)據(jù)顯示，除了定位運輸以外，更表明其功能與脂質(zhì)具有密切關(guān)系。
　　4）對擬南芥和水稻的n

5、sLTPs家族的不同時期和組織部位的表達譜芯片表達和聚類分析，發(fā)現(xiàn)nsLTPs在擬南芥中的分布十分廣泛，但是其表達數(shù)據(jù)仍遵循著一定的規(guī)律，這一定程度上佐證了部分nsLTPs基因?qū)τ诮琴|(zhì)層的合成和花藥部分絨氈層的形成有重要的作用。
　　5）通過比對水稻和擬南芥這兩種植物的nsLTPs的表達數(shù)據(jù)，我們可以發(fā)現(xiàn)nsLTPs在花藥發(fā)育的不同時期的表達情況有較大差異，表現(xiàn)出了較高的廣譜性和互補性，從而顯現(xiàn)出完善的功能分工和協(xié)調(diào)控制。

6、　　本研究研究結(jié)果以期為將來研究nsLTPs在植物中的遺傳學(xué)功能、以及雄性不育應(yīng)用提供相應(yīng)的理論依據(jù)。
　?。ǘ㏑CHY1與CSA互作的功能機理初步探討
　　了解植物花藥發(fā)育和花粉發(fā)育過程，對于提高人們對植物基本生命現(xiàn)象的認識以及作物雜交育種提高農(nóng)業(yè)產(chǎn)量具有重要意義。我們實驗室前期已經(jīng)分離鑒定到一個控制水稻葉片中糖到花器官（包括花藥）分配的關(guān)鍵MYB轉(zhuǎn)錄因子CSA(Carbon Starved Anther)，該轉(zhuǎn)錄因子可

7、以直接控制花藥中單糖轉(zhuǎn)移酶的表達，從而實現(xiàn)對糖分子從源到庫分配的調(diào)節(jié)。因此，進一步研究CSA可能相互作用蛋白以及參與的生物學(xué)過程，對于解釋CSA的功能具有重要意義。
　　本研究以期通過構(gòu)建花藥發(fā)育過程中的酵母雙雜交文庫，來篩選和CSA相互作用的蛋白，研究結(jié)果表明，我們獲得了4個可能與CSA的互作蛋白，其中，我們重點關(guān)注了E3泛素連接酶家族中RCHY1（Ring finger and CHY1 finger）基因，通過酵母雙雜交驗證

8、以及使用qRT-PCR對CSA及RCHY1進行表達量分析進一步驗證其可能存在的生物學(xué)關(guān)系，以及嘗試通過Crispr的方法獲得RCHY1敲除突變體，在遺傳學(xué)上分析其可能的生物學(xué)功能。
　　同時通過生物信息學(xué)的方法，對RCHY1在全物種中進行進化樹分析，結(jié)果表明 RCHY1這個基因是廣泛存在于生物界中從被子植物到裸子植物，到動物再到單細胞生物鐘都有分布。而E3泛素連接酶家族在大部分的泛素化過程中，特異的決定了底物蛋白的選擇和泛素的鏈接