CRD誘發(fā)大鼠DRG神經(jīng)元高敏感性的發(fā)生機(jī)制及乳酸桿菌的干預(yù)作用.pdf

1、內(nèi)臟痛是許多胃腸道疾病最常見(jiàn)的癥狀之一，但其發(fā)生機(jī)制還不清楚。目前認(rèn)為，內(nèi)臟異常疼痛的產(chǎn)生主要?dú)w結(jié)為外周敏感化和中樞敏感化。各種原因引起的內(nèi)臟組織和初級(jí)傳入神經(jīng)元的敏感化可以誘導(dǎo)和易化中樞敏感化，所以了解初級(jí)神經(jīng)元敏感化的機(jī)制，探索降低其興奮性的方法對(duì)干預(yù)痛覺(jué)信號(hào)的傳導(dǎo)、控制疼痛具有重要意義。
　　 內(nèi)臟感覺(jué)主要通過(guò)結(jié)狀神經(jīng)節(jié)與脊髓背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganlia，DRG)傳入到次級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元，其中一般的內(nèi)臟感覺(jué)

2、主要通過(guò)結(jié)狀神經(jīng)節(jié)傳導(dǎo)，而痛覺(jué)主要通過(guò)DRG神經(jīng)元傳導(dǎo)。按其直徑不同，DRG神經(jīng)元可以分為大型神經(jīng)元(39-50μm)、中型神經(jīng)元(33-38μm)和小型神經(jīng)元(19-27μm)三類。其中，中、小型神經(jīng)元主要發(fā)出細(xì)髓的Aδ纖維和無(wú)髓的C類纖維，傳遞傷害性感覺(jué)，與痛覺(jué)產(chǎn)生密切相關(guān)。因此，DRG中的中小神經(jīng)元是內(nèi)臟痛覺(jué)信號(hào)傳導(dǎo)與調(diào)控的初級(jí)靶點(diǎn)。
　　 電壓依賴性鈉通道決定神經(jīng)細(xì)胞動(dòng)作電位的產(chǎn)生和傳導(dǎo)，它的改變對(duì)于神經(jīng)元的興奮性具有重

3、要的影響。鈉通道由一個(gè)α亞單位和兩個(gè)β亞單位組成。目前已經(jīng)克隆出九種α亞單位，并據(jù)此將電壓依賴性鈉通道分為9種類型，即Nav1.1-Nav1.9。根據(jù)其對(duì)河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)的敏感性又可分為河豚毒素敏感(TTX-sensitive，TTX-S)和河豚毒素不敏感(TTX-resistant，TTX-R)兩種類型。其中，Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.6和Nav1.7屬于TTX-S鈉

4、通道，而Nav1.5，Nav1.8和Nav1.9屬于TTX-R鈉通道。Nav1.3、Nav1.7、Nav1.8和Nav1.9參與痛覺(jué)信號(hào)的調(diào)控。一些誘發(fā)疼痛的病理性因素影響DRG細(xì)胞中鈉通道的表達(dá)和功能，改變DRG細(xì)胞的興奮性。
　　 BDNF(brain-derived neurotrophic factor)是一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，廣泛存在于中樞與外周神經(jīng)系統(tǒng)中。以往的研究認(rèn)為，BDNF的主要作用是調(diào)節(jié)突觸的可塑性和神經(jīng)遞質(zhì)的釋

5、放，參與學(xué)習(xí)和記憶過(guò)程。但近來(lái)越來(lái)越多研究發(fā)現(xiàn)，BDNF也參與對(duì)痛覺(jué)傳導(dǎo)的調(diào)控。在脊髓中，BDNF由DRG細(xì)胞合成后被運(yùn)輸?shù)街袠卸耍诩顾韬蠼轻尫?，與第二級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元上的Trk B受體結(jié)合，調(diào)節(jié)突觸傳遞和脊髓痛覺(jué)的傳導(dǎo)，導(dǎo)致中樞神經(jīng)元興奮性的改變。BDNF還可以通過(guò)自分泌和旁分泌的方式調(diào)節(jié)DRG神經(jīng)元的興奮性。
　　 腸道益生菌是與人類共生的、具有治療或保健作用的細(xì)菌，主要包括乳酸桿菌(Lactobacillus reuteri

6、)和雙歧桿菌。它們能夠調(diào)節(jié)炎癥引起的腸道敏感性的改變，調(diào)節(jié)腸道內(nèi)在感覺(jué)神經(jīng)元的興奮性，對(duì)一些腸道疾病包括腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)和炎癥性腸道疾病等所引起的腹部不適癥狀具有明顯的改善作用。
　　 由于重復(fù)的結(jié)直腸擴(kuò)張刺激(colorectal distention，CRD)能夠誘導(dǎo)內(nèi)臟高敏感性，本課題研究該模型大鼠DRG神經(jīng)元興奮性的改變及其機(jī)制，探討鈉通道和BDNF在DRG興奮性改

7、變中所起的作用，并進(jìn)一步研究乳酸桿菌對(duì)DRG興奮性改變的調(diào)節(jié)作用及其相關(guān)機(jī)制。本課題將揭示DRG神經(jīng)元興奮性的改變?cè)趦?nèi)臟高敏感性發(fā)生中的作用，并為尋找新的鎮(zhèn)痛藥物提供依據(jù)。
　　 研究目的：
　　 1探討CRD對(duì)大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸DRG神經(jīng)元興奮性的影響。
　　 2探討CRD后大鼠DRG神經(jīng)元電壓依賴性鈉通道表達(dá)和功能是否發(fā)生改變。
　　 3研究CRD對(duì)大鼠DRG神經(jīng)元BDNF表達(dá)的影響及外源性BDNF在CRD

8、致大鼠DRG神經(jīng)元敏感化過(guò)程中所起的作用。
　　 4探討乳酸桿菌對(duì)CRD后大鼠DRG神經(jīng)元敏感性的影響及其機(jī)制。
　　 研究方法和結(jié)果：
　　 1結(jié)直腸擴(kuò)張內(nèi)臟痛模型的建立
　　 1.1 DRG神經(jīng)元的逆行標(biāo)記
　　 健康雄性SD大鼠，腹腔注射麻醉，打開(kāi)腹腔，找到結(jié)腸遠(yuǎn)端，向結(jié)腸壁注射1，1-dioctadecyl-3-3-3-3-tetramethylindocarbocyanine(DiI，5

9、mg/ml)，注射6到10個(gè)點(diǎn)(1.0μl/injection)，縫合腹壁。
　　 1.2 CRD內(nèi)臟痛模型的建立
　　 注射DiI兩周后，大鼠腹腔內(nèi)注射氯胺酮(75mg/kg)與甲苯噻嗪(10mg/g)麻醉，利用Barostat system(Distender,G& J Electronic Inc)給予1小時(shí)重復(fù)的CRD刺激(80 mm Hg，30s on，30 s off)，對(duì)照組只給予氯胺酮與甲苯噻嗪腹腔注射麻

10、醉，不給予CRD刺激。
　　 2擴(kuò)張腸段MPO活性檢測(cè)
　　 大鼠處死后，取擴(kuò)張的遠(yuǎn)端結(jié)腸段，根據(jù)試劑盒(南京建成生物工程研究所)說(shuō)明書(shū)檢測(cè)單位結(jié)腸重量中MPO的活性。結(jié)果顯示，同no CRD組相比，在分別給予CRD后1h、3h、6h、12h、24h，其MPO活性未見(jiàn)明顯增加。
　　 3 RT-PCR檢測(cè)CRD后不同時(shí)間段DRG中BDNF mRNA含量的表達(dá)
　　 提取DRG中mRNA，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在CRD后

11、3h、6h、12h、24h，DRG中的BDNF mRNA含量明顯增高。
　　 4 ELISA檢測(cè)CRD后不同時(shí)間段DRG中BDNF蛋白含量的變化
　　 提取DRG中蛋白，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)同正常DRG相比，CRD后1h、3h、6h、12h、24h，DRG中BDNF蛋白含量明顯增高。
　　 5 DRG細(xì)胞的培養(yǎng)
　　 給予CRD刺激之后，立刻頸椎脫臼犧牲大鼠，取出腰骶段脊柱，取出兩邊的DRG；置于Krebs溶液中；加

12、入膠原酶I(1mg/ml)和胰酶(0.25％)，37℃消化50min，接種于包被了PLL的35mm培養(yǎng)皿中，37℃，5％CO2，95％O2培養(yǎng)過(guò)夜。
　　 6膜片鉗記錄
　　 6.1 CRD細(xì)胞自發(fā)放電
　　 在電流鉗模式下，I=0，記錄細(xì)胞自發(fā)放電的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，no CRD組，自發(fā)放電的細(xì)胞占7.3％；CRD組自發(fā)放電細(xì)胞數(shù)量有所增加占9.4％，兩者未見(jiàn)顯著性差異。
　　 6.2 CRD刺激之后動(dòng)作

13、電位的產(chǎn)生和各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)
　　 記錄刺激動(dòng)作電位產(chǎn)生所需要的基強(qiáng)度和2倍、3倍基強(qiáng)度刺激產(chǎn)生動(dòng)作電位的數(shù)量。結(jié)果顯示，在給予1h重復(fù)CRD刺激后，DRG神經(jīng)元產(chǎn)生動(dòng)作電位基強(qiáng)度降低，2倍、3倍基強(qiáng)度刺激誘發(fā)DRG神經(jīng)元產(chǎn)生動(dòng)作電位的數(shù)量增多，說(shuō)明CRD后DRG神經(jīng)元的興奮性明顯增高。
　　 6.3 CRD對(duì)大鼠DRG神經(jīng)元鈉電流的影響
　　 電極電阻控制在2-4 MΩ，所有的鈉電流在細(xì)胞成為全細(xì)胞之后5分鐘進(jìn)行

14、記錄，串聯(lián)電阻被補(bǔ)償85-90％。分別記錄no CRD組和CRD組大鼠DRG細(xì)胞鈉通道的激活、失活及復(fù)活電流的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在CRD后，大鼠DRG細(xì)胞上TTX-S和slow TTX-R鈉通道的激活和復(fù)活過(guò)程沒(méi)有發(fā)生明顯的改變，而其失活曲線向去極化方向移動(dòng)，表明其失活電壓依賴性發(fā)生改變。
　　 6.4 BDNF對(duì)正常及CRD大鼠DRG神經(jīng)元興奮性的影響
　　 研究發(fā)現(xiàn)，no CRD組在加入5ng/ml BDNF5min后

15、，DRG動(dòng)作電位閾值及動(dòng)作電位的產(chǎn)生頻率都未見(jiàn)變化，而幅值、去極化的速率明顯下降；在CRD組中神經(jīng)元加入同樣劑量的BDNF后，DRG神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏拈撝得黠@升高，給予3倍基強(qiáng)度刺激誘發(fā)DRG神經(jīng)元產(chǎn)生動(dòng)作電位的數(shù)量減少。說(shuō)明BDNF下調(diào)CRD后DRG神經(jīng)元的敏感性。
　　 6.5乳酸桿菌對(duì)正常及CRD大鼠DRG神經(jīng)元敏感性的影響。
　　 用乳酸桿菌(5×109CFU/ml)連續(xù)灌胃對(duì)正常大鼠DRG神經(jīng)元的電生理特性沒(méi)有影

16、響，但明顯升高CRD后DRG神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢划a(chǎn)生的基強(qiáng)度，降低動(dòng)作電位的去極化速率及產(chǎn)生頻率，說(shuō)明乳酸桿菌下調(diào)CRD后DRG神經(jīng)元的興奮性。
　　 結(jié)論：
　　 1遠(yuǎn)端結(jié)腸受到80mmHg的CRD刺激1h后，可以引起相應(yīng)節(jié)段DRG細(xì)胞興奮性明顯增加。
　　 2 CRD后DRG神經(jīng)元電壓依賴性鈉通道失活動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變，這可能是CRD導(dǎo)致DRG細(xì)胞高敏感性的發(fā)生的原因之一。
　　 3內(nèi)源性BDNF可能下調(diào)CRD