染色體10q11區(qū)域與中國(guó)人群前列腺癌易感性的“精細(xì)定位”研究和功能分析.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　第一部分 染色體10q11區(qū)域與中國(guó)人群前列腺癌易感性的“精細(xì)定位”研究
　　背景:目前已有20多個(gè)GWAS(Genome-wide association studies，全基因組相關(guān)聯(lián)研究）在16條染色體上發(fā)現(xiàn)了70多個(gè)與前列腺癌遺傳易感性相關(guān)的SNPs（Single nucleotide polymorphisms，單核苷酸多態(tài)性），這其中包括由三項(xiàng)GWAS在10q11區(qū)域發(fā)現(xiàn)的r

2、s10993994位點(diǎn)。由于目前大多數(shù)GWAS發(fā)現(xiàn)的易感SNPs與前列腺癌發(fā)病的真正機(jī)制尚不清楚，導(dǎo)致GWAS的研究成果向臨床獲益轉(zhuǎn)化時(shí)遇到諸多困難。一般而言，要研究GWAS發(fā)現(xiàn)的某一SNP在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制需要兩步，第一步是對(duì)該SNP所在區(qū)域進(jìn)行“精細(xì)定位(finemapping)”研究，目的是為了排除連鎖不平衡的干擾，找出目標(biāo)區(qū)域真正影響前列腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的SNP;第二步是依據(jù)SNPs所在基因組的位置信息和前后背景進(jìn)行功能分析

3、。
　　目的:本部分在中國(guó)人群中對(duì)染色體10q11區(qū)域進(jìn)行“精細(xì)定位”研究，找出該區(qū)域中真正影響到前列腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的位點(diǎn)。
　　方法:我們利用ChinaPCa(Chinese Consortium for Prostate CancerGenetics，中國(guó)前列腺癌遺傳學(xué)協(xié)作組)從多個(gè)中心收集到的1755例前列腺癌患者和1523例健康對(duì)照個(gè)體的血液樣本進(jìn)行此項(xiàng)研究。從HapMapⅡ期中國(guó)人群的數(shù)據(jù)庫(kù)中，在chr10:5119

4、4000-51259000的65kh范圍內(nèi)，按照r2≥0.8，最小等位基因頻率≥0.05的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行SNPs篩選，共選取12個(gè)SNPs位點(diǎn);在dbSNPs數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行補(bǔ)充，通過(guò)對(duì)MSMB(Microseminoprotein beta，微精液蛋白β)基因和NCOA4（Nuclear receptor coactivator4，細(xì)胞核受體輔激活物4）基因（10q11區(qū)域的兩個(gè)基因）潛在功能區(qū)域的SNPs分析后，再選出3個(gè)SNPs（其中2個(gè)與

5、上述12個(gè)重復(fù)，總共13個(gè)）。利用Sequenom基因分型技術(shù)平臺(tái)對(duì)樣本的DNA中的13個(gè)SNPs進(jìn)行基因分型。最后用卡方檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析各位點(diǎn)與前列腺癌遺傳易感性的關(guān)系。
　　結(jié)果:13個(gè)SNPs中有一個(gè)位點(diǎn)(rs4630240)在基因分型中應(yīng)答失敗，其余的12個(gè)SNPs的應(yīng)答率在98.3％-99.5％之間，應(yīng)答反應(yīng)良好。在P＜0.01的水平上，健康對(duì)照組所有的12個(gè)SNPs的基因型頻率都符合哈代-溫伯格平衡。12個(gè)SNPs中有3個(gè)

6、與前列腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)(P＜0.05)，分別是rs10993994(風(fēng)險(xiǎn)等位基因?yàn)門(mén)，P=0.012，OR=1.14)、rs10821609（風(fēng)險(xiǎn)等位基因?yàn)門(mén)，P=0.030，OR=1.15)、rs10821610（風(fēng)險(xiǎn)等位基因?yàn)镚，P=0.008，OR=1.16）;經(jīng)過(guò)年齡校正后仍是上述三個(gè)SNPs與前列腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)(P值分別為0.011、0.028、0.009)。計(jì)算三者之間的r2值分別為:0.18(rs10993994 vs

7、 rs10821609)、0.05(rs10993994 vs rs10821610)和0.44(rs10821609 vs rs10821610)。通過(guò)條件logistic回歸模型，調(diào)整去除其中一個(gè)SNP對(duì)另外兩個(gè)SNPs的影響后發(fā)現(xiàn)，在P＜0.05的水平上，只有rs10821610在去除rs10993994的影響后仍然與前列腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)(P=0.03)。
　　結(jié)論:染色體10q11區(qū)域中的rs10993994、rs108

8、21609和rs10821610與中國(guó)人群前列腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，其中rs10821610最為顯著:rs10993994和rs10821610之間不存在連鎖不平衡，而rs10993994和rs10821609以及rs10821609和rs10821610之間存在著連鎖不平衡，但連鎖的程度較輕;這三個(gè)SNPs可能并非獨(dú)立參與到前列腺癌的發(fā)病，而是相互影響共同參與到前列腺癌的發(fā)病，相互影響的原因可能是連鎖不平衡，也可能是其他原因。
　

9、　第二部分 rs10993994對(duì)前列腺癌細(xì)胞MSMB基因啟動(dòng)子活性的影響
　　背景:染色體10q11區(qū)域的SNP:rs10993994能影響中國(guó)及歐美人群前列腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，該位點(diǎn)位于MSMB(microseminoprotein beta，微精液蛋白β)基因的啟動(dòng)子區(qū)域，而MSMB基因及其編碼表達(dá)的PSP94(Prostatic secretaryprotein94，前列腺分泌蛋白94)異常與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。
　

10、　目的:本部分將探討rs10993994對(duì)前列腺癌細(xì)胞MSMB基因啟動(dòng)子活性的影響。
　　方法:化學(xué)合成MSMB基因的啟動(dòng)子序列(MSMB轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游299bp至下游36bp)，根據(jù)位于序列中間的SNP rs10993994有兩種等位基因(T/C)可能，合成兩條啟動(dòng)子MSMB promoter-T和MSMB promoter-C。將兩條啟動(dòng)子通過(guò)酶切的方法導(dǎo)入熒光素酶報(bào)告基因載體(pGL3-basic vectors)中，篩選陽(yáng)

11、性克隆后，將攜帶啟動(dòng)子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入前列腺癌細(xì)胞PC-3和LNCaP中，培養(yǎng)48小時(shí)后通過(guò)熒光檢測(cè)儀來(lái)檢測(cè)重組質(zhì)粒中啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的活性。
　　結(jié)果:成功合成兩條啟動(dòng)子MSMB promoter-T和MSMB promoter-C，并分別將其與熒光素酶報(bào)告基因載體重組，形成重組質(zhì)粒pGL3-MSMB promoter-T和pGL3-MSMB promoter-C。在前列腺癌細(xì)胞PC-3中，重組質(zhì)粒MSMB promoter-C組的相

12、對(duì)熒光度為2.27±0.39，顯著高于重組質(zhì)粒MSMB promoter-T組(0.57±0.13)（P＜0.05）;在前列腺癌細(xì)胞LNCaP中，重組質(zhì)粒MSMB promoter-C組的相對(duì)熒光度為1.70±0.32，顯著高于重組質(zhì)粒MSMB promoter-T組(0.37±0.09)(P＜0.05)。
　　結(jié)論:在前列腺細(xì)胞中重組質(zhì)粒pGL3-MSMB promoter-C的轉(zhuǎn)錄活性要強(qiáng)于重組質(zhì)粒pGL3-MSMB prom