內(nèi)源性大麻素anandamide和蟲卵抗原對(duì)血吸蟲肝纖維化小鼠體內(nèi)-外影響的初步探討.pdf

1、第Ⅰ節(jié)內(nèi)源性大麻素Anandamide對(duì)血吸蟲肝纖維化小鼠原代肝星狀細(xì)胞增殖和死亡的影響
　　目的：研究內(nèi)源性大麻素AEA對(duì)血吸蟲肝纖維化小鼠原代肝星狀細(xì)胞(HSC)增殖及細(xì)胞死亡的影響。
　　方法：1)應(yīng)用尾蚴貼敷腹部皮膚的方法建立不同時(shí)期的血吸蟲肝損傷小鼠模型,肝臟組織的HE染色及Masson染色證實(shí)模型建立成功,分別計(jì)算肝臟組織、脾臟組織和腎臟組織的指數(shù)。
　　2)全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血吸蟲肝纖維化小鼠模型血清中的轉(zhuǎn)

2、氨酶(ALT和AST)含量。
　　3)應(yīng)用非連續(xù)梯度密度離心法分離原代HSC,α-SMA和desmin免疫熒光雙重染色鑒定分離的細(xì)胞,胎盤藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)計(jì)算分離的細(xì)胞的活性。
　　4)應(yīng)用噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)AEA對(duì)原代HSC增殖的影響并用SPSS軟件計(jì)算AEA的IC50。
　　5)應(yīng)用AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AEA誘導(dǎo)的HSC死亡。
　　6)應(yīng)用DAPI染色觀察在AEA的作用下原代

3、HSC細(xì)胞核形態(tài)的變化。
　　結(jié)果：1)HE染色和Masson染色顯示,在尾蚴感染的第6周小鼠的肝臟組織出現(xiàn)類圓形的嗜酸性肉芽腫,蟲卵在血管沉積,炎癥細(xì)胞浸潤,藍(lán)色的膠原纖維在肝臟組織呈同心圓狀沉積。隨著時(shí)間的推移,肝細(xì)胞的嗜酸性壞死和纖維化程度逐漸加重。與正常組的肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)(4.75％±0.80%,0.43%±0.07%)比較,第6、9、11周尾蚴感染后小鼠肝臟指數(shù)(6.27%±0.56%,8.40%±1.43%,7.4

4、8%±1.32%,P<0.05,P<0.01)和脾臟指數(shù)(1.24%±0.37%,2.47%±0.46%,2.62%±1.23%,P<0.05,P<0.01)明顯升高,而腎臟指數(shù)則沒有明顯變化。
　　2)與正常組(ALT:30.90±1.44,AST:114.00±5.07)相比,谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)在第3周開始明顯升高(ALT:91.00±1.36,AST:232.10±2.54,P<0.01),第6周達(dá)到

5、高峰(ALT:176.22±7.08,AST:319.67±9.96,P<0.01),在第9周(ALT:103.60±4.34,AST:197.40±5.58,P<0.01)和第11周(ALT:50.13±3.12,AST:203.88±4.14,P<0.01)下降但仍明顯高于正常水平。
　　3)α-SMA和desmin免疫熒光雙重染色發(fā)現(xiàn),分離的HSC純度為95%,細(xì)胞活性為90%。
　　4)MTT比色法顯示不同濃度的AE

6、A對(duì)原代HSC增殖的抑制率分別為:5μM組為5.14%±1.61%、10μM組為10.34%±3.22%、20μM組為14.12%±3.98%、40μM組為18.64%±3.67%、60μM組為23.86%±3.06%、80μM組為62.81%±7.75%、100μM組為70.39%±7.11%、120μM組為72.31%±6.71%,AEA的IC50值為79.06±9.38μM。
　　5)AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)的流

7、式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果顯示,不同濃度的AEA誘導(dǎo)原代HSC的死亡率分別為:0μM組為9.5%±3.19%、5μM組為9.8%±2.28%、10μM組為11.18%±1.82%、20μM組為12.2%±2.39%、40μM組為15.1%±1.88%、60μM組為45.85%±4.73%、80μM組為63.04%±7.00%、100μM組為73.32%±4.62%、120μM組為89.47%±8.84%。
　　6)DAPI染色的結(jié)果顯示AEA

8、處理的原代HSC的細(xì)胞核腫脹破裂,染色質(zhì)固縮成顆粒狀,部分細(xì)胞的核內(nèi)容物溢出。
　　結(jié)論：在尾蚴感染后的第6周,小鼠的肝臟組織出現(xiàn)嗜酸性肉芽腫和膠原纖維及蟲卵的沉積,肝臟組織和脾臟組織逐漸腫大,尾蚴貼敷腹部皮膚的方法可成功建立早期及晚期血吸蟲肝損傷小鼠模型。AEA可呈濃度依賴性地抑制原代HSC的增殖并促進(jìn)其壞死。
　　第Ⅱ節(jié) 脂筏、大麻素受體及氧化應(yīng)激對(duì)anandamide誘導(dǎo)的原代肝星狀細(xì)胞增殖壞死、MAPK信號(hào)通路和細(xì)胞

9、因子的影響
　　目的：探討原代HSC胞膜的脂筏、大麻素受體(CB)及氧化應(yīng)激對(duì)AEA誘導(dǎo)的原代HSC增殖壞死及MAPK信號(hào)通路的影響,對(duì)細(xì)胞因子IL-6,MCP-1,TNF-α及IL-1β表達(dá)的影響。
　　方法：1)Western-blotting檢測(cè)AEA與MAPK主要成員P-Erk1/2,P-P38和P-JNK1/2的時(shí)間及濃度的關(guān)系。
　　2)分別用膽固醇耗竭劑MCD破壞脂筏的完整性,CB1受體拮抗劑SR1417

10、16及CB2受體拮抗劑AM631阻斷AEA與其相應(yīng)受體的結(jié)合,抗氧化劑NAC清除自由基,應(yīng)用AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)的流式細(xì)胞術(shù)觀察上述處理對(duì)AEA誘導(dǎo)的原代肝星狀細(xì)胞死亡影響。
　　3)應(yīng)用MTT觀察MCD,SR141716和AM639及NAC對(duì)AEA誘導(dǎo)的原代HSC死亡率的影響。
　　4)Western-blotting觀察MCD,SR141716和AM639及NAC對(duì)AEA誘導(dǎo)的MAPK信號(hào)通路激活及半胱氨

11、酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)表達(dá)的影響。
　　5)RT-PCR檢測(cè)MCD,SR141716和AM639及NAC對(duì)AEA誘導(dǎo)的細(xì)胞因子IL-6,MCP-1,TNF-α及IL-1β表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：1)AEA可呈時(shí)間和濃度依賴性地促進(jìn)P-Erk1/2,P-P38及P-JNK1/2的表達(dá):在AEA濃度為20μM的時(shí)候開始促進(jìn)P-Erk1/2,P-P38及P-JNK1/2的表達(dá),隨濃度升高表達(dá)逐漸增加(P均<0.

12、05)。在AEA分別孵育15min,30min,1h,3h,6h時(shí)P-Erk1/2和P-P38的表達(dá)較高,而后逐漸下降。在15min,30min,1h時(shí),P-JNK1/2的表達(dá)較高,而后逐漸下降。
　　2)MCD和NAC可降低AEA誘導(dǎo)的原代HSC的死亡率(P均<0.05),而SR141716和AM630則無明顯作用。
　　3)MCD和NAC可降低AEA對(duì)原代HSC增殖的抑制(P<0.05),而大麻素受體則無明顯作用。

13、>　　4)MCD、SR141716和NAC可抑制AEA誘導(dǎo)的P-Erk1/2、P-P38及P-JNK1/2的表達(dá)(P均<0.05),AM630僅能抑制P-P38的表達(dá)(P<0.05),而上述處理因素均對(duì)原代HSC內(nèi)caspase-3的表達(dá)無明顯影響。
　　5)AEA能誘導(dǎo)IL-6的表達(dá)增加,MCD、SR141716、AM630及NAC均可降低AEA誘導(dǎo)的IL-6的表達(dá)(P均<0.05)。AEA可抑制MCP-1的表達(dá)(P<0.05)

14、,MCD、SR141716及NAC對(duì)AEA誘導(dǎo)的MCP-1表達(dá)則無明顯的影響,而AM630則能明顯促進(jìn)MCP-1的表達(dá)(P<0.05)。AEA能降低TNF-α和IL-1β的表達(dá)(P均<0.05),MCD、SR141716及NAC可進(jìn)一步抑制AEA誘導(dǎo)的TNF-α和IL-1β的表達(dá)(P均<0.05),而AM630則增強(qiáng)AEA誘導(dǎo)的TNF-α和IL-1β的表達(dá)(P均<0.05)。
　　結(jié)論：內(nèi)源性大麻素AEA可通過呈濃度和時(shí)間依賴性地

15、激活MAPK信號(hào)通路促進(jìn)原代HSC的壞死。脂筏及氧化應(yīng)激是AEA誘導(dǎo)原代HSC壞死和抑制其增殖的必要條件,而與其胞膜的特異性大麻素受體無關(guān)。AEA可能是體內(nèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)的免疫分子。
　　第Ⅲ節(jié)內(nèi)源性大麻素anandmide對(duì)原代肝星狀細(xì)胞內(nèi)ROS和NADPH氧化酶的影響
　　目的：觀察不同劑量的內(nèi)源性大麻素AEA對(duì)原代HSC內(nèi)ROS的影響,觀察AEA和MCD對(duì)NADPH氧化酶亞基gp91-phox和p47-phox表達(dá)的

16、影響,并觀察脂筏、大麻素受體及NADPH氧化酶在AEA誘導(dǎo)原代HSC內(nèi)ROS產(chǎn)生過程中的作用,
　　方法：1)利用熒光探針DCFH-DA可自由進(jìn)入HSC胞膜,細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細(xì)胞膜,從而使探針被裝載到細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)DCF的強(qiáng)度可間接反映原代HSC內(nèi)ROS的水平。
　　2)Western-blotting檢測(cè)MCD對(duì)AEA誘導(dǎo)

17、的原代HSC內(nèi)NADPH氧化酶亞基gp91-phox和p47-phox表達(dá)的影響,計(jì)算各組目的條帶與β-actin灰度值的平均比值反應(yīng)蛋白表達(dá)量。
　　3)觀察大麻素受體拮抗劑SR141716或AM630,MCD及NADPH氧化酶抑制劑DPI和Apocynin,抗氧化劑NAC對(duì)AEA誘導(dǎo)的原代HSC內(nèi)ROS產(chǎn)生的影響。
　　結(jié)果：1)隨著內(nèi)源性大麻素AEA濃度的升高,原代HSC內(nèi)ROS的水平逐漸升高。不同濃度的AEA誘導(dǎo)的R

18、OS水平分別為:0μM組4.4±1.52,5μM組24.52±7.35,10μM組28.31±5.87,20μM組47.07±7.92,40μM組61.22±10.69,60μM組89.99±16.35,80μM組106.48±19.58,100μM組95.93±13.74,120μM組96.78±14.83。
　　2)AEA可促進(jìn)原代HSC內(nèi)NADPH氧化酶亞基gp91-phox和p47-phox的表達(dá)(P均<0.05),加入M

19、CD后其表達(dá)明顯降低(P<0.05)。①gp91-phox:各組與β-actin的平均比值分別為陰性對(duì)照組0.13±0.01,20μMAEA組0.29±0.03,60μMAEA組0.35±0.02,60μMAEA+MCD組0.20±0.01。②p47-phox:各組與β-actin的平均比值分別為陰性對(duì)照組0.06±0.01,20μMAEA組0.40±0.04,60μMAEA組0.66±0.06,60μMAEA+MCD組0.36±0.0

20、3。
　　3)SR141716和AM630并不能阻止AEA誘導(dǎo)的原代HSC內(nèi)ROS的產(chǎn)生,而加入MCD和NAC后AEA誘導(dǎo)的原代HSC內(nèi)ROS的水平明顯降低(P均<0.05),加入NADPH氧化酶抑制劑DPI和Apocunin后AEA誘導(dǎo)的原代HSC內(nèi)ROS產(chǎn)生雖然有所降低,但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組的ROS水平分別為DMSO組6.52±2.78,20μMAEA組48.75±6.81,60μMAEA組105.87±

21、15.79,60μMAEA+SR141716組107.85±10.57,60μMAEA+AM630組108.57±19.38,60μMAEA+MCD組40.35±5.82,60μMAEA+DPI+Apocynin組94.39±21.94,60μMAEA+MCD組35.96±7.59。
　　結(jié)論：①AEA可呈濃度依賴性地促進(jìn)原代HSC內(nèi)ROS的產(chǎn)生。②內(nèi)源性大麻素AEA促進(jìn)NADPH氧化酶亞基gp91-phox和p47-phox的磷

22、酸化依賴原代HSC胞膜脂筏的完整性。③AEA通過促進(jìn)NADPH氧化酶亞基的磷酸化激活該酶,促進(jìn)原代HSC內(nèi)ROS的產(chǎn)生,而抑制NADPH氧化酶的活性后并不能阻止AEA誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生,表明NADPH氧化酶并不是AEA誘導(dǎo)原代HSC產(chǎn)生的ROS的主要來源。
　　第Ⅳ節(jié) 內(nèi)源性大麻素anandmide對(duì)血吸蟲肝纖維化小鼠肝功能和病理學(xué)的影響
　　目的：觀察AEA對(duì)血吸蟲肝纖維化小鼠肝功能和病理學(xué)的影響。
　　方法1)制備血

23、吸蟲肝纖維化小鼠模型,將不同劑量的AEA(5mg/kg和10mg/kg)分別腹腔注射入小鼠體內(nèi),1次/天,共4周,計(jì)算各組每只小鼠的肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)。
　　2)全自動(dòng)生化儀檢測(cè)各組小鼠血清內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST的含量。
　　3)HE染色觀察各組肝臟組織的病理學(xué)變化。
　　4)Masson染色觀察膠原纖維的沉積情況,并用Image-pro-plus軟件計(jì)算膠原纖維的含量。
　　結(jié)果：1)血吸蟲肝纖維化小鼠模型制備

24、成功。與正常小鼠相比,模型組、5mg/kgAEA組和10mg/kgAEA組的肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)明顯升高(P均<0.05)。與模型組比較,5mg/kgAEA組和10mg/kgAEA組的肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)則無明顯的變化。
　　2)與正常組比較,模型組、5mg/kgAEA組和10mg/kgAEA組的ALT和AST的含量明顯升高(P均<0.05)。與模型組比較,5mg/kgAEA組和10mg/kgAEA組的ALT和AST明顯升高,差別具有

25、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05),而5mg/kgAEA組和10mg/kgAEA組在ALT和AST則無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3)HE染色結(jié)果顯示與正常小鼠的肝臟組織相比,模型組、5mg/kgAEA組和10mg/kgAEA組均出現(xiàn)蟲卵在血管的沉積,急慢性嗜酸性肉芽腫的形成,炎癥細(xì)胞的浸潤。與模型組比較,5mg/kgAEA組和10mg/kgAEA組的急慢性嗜酸性肉芽腫結(jié)節(jié)和炎癥細(xì)胞浸潤的面積增加。
　　4)Masson染色顯示,在正常

26、小鼠的肝臟組織中除組成血管的膠原纖維外,無膠原纖維的沉積,在模型組、5mg/kgAEA組和10mg/kgAEA組出現(xiàn)明顯的圍繞血管呈同心圓狀的膠原沉積,膠原纖維的含量明顯增加(P均<0.05),而與模型組相比,5mg/kgAEA組和10mg/kgAEA組膠原纖維的含量無明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：短期應(yīng)用AEA可加劇血吸蟲肝纖維化模型小鼠的肝功能,不能阻止肝纖維化的發(fā)展。
　　結(jié)論日本血吸蟲可溶性抗原在肝纖維化的早期和晚期