過(guò)表達(dá)大鼠ACE細(xì)胞模型的建立與ACE抑制劑篩選模型的研究.pdf

1、目的：構(gòu)建pEGFP-ACE真核表達(dá)載體，并利用HepG2細(xì)胞建立過(guò)表達(dá)大鼠血管緊張素轉(zhuǎn)化酶I（AngiotensinIConvertingEnzyme，ACE）的細(xì)胞模型，為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（Angiotensin-convertingenzymeinhibitors，ACEI）類藥物的篩選提供研究工具。
　　方法：①pEGFP-ACE真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定：Trizol法提取大鼠肺組織總RNA，利用RT-PCR（Rev

2、erseTranscriptionPolymeraseChainReaction）的方法得到ACEcDNA，回收純化目的基因，并與質(zhì)粒pEGFP-C1經(jīng)SalI和Acc65I雙酶切的產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α，在含有卡那霉素（30μg/ml）的LB瓊脂平板上培養(yǎng)過(guò)夜，挑取和篩選陽(yáng)性克隆。酶切鑒定后的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，用BLAST軟件與GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性分析。
　?、贖epG2細(xì)胞

3、的轉(zhuǎn)染和重組大鼠ACE蛋白的表達(dá)及檢測(cè)：提取的重組質(zhì)粒pEGFP-ACE，在250V，20ms的條件下電轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞，Westernblot鑒定重組ACE蛋白的表達(dá)情況；利用pEGFP載體的G418抗性，篩選出過(guò)表達(dá)ACE的細(xì)胞株。
　?、跘CE活性的測(cè)定：利用馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（hippuryl–L–histidyl-L-leucine，HHL)可在ACE的催化下迅速分解產(chǎn)生馬尿酸(hippur

4、icacid，HA)，以高效液相色譜法(high-performanceliquidchromatography，HPLC)測(cè)定反應(yīng)液中的馬尿酸生成量來(lái)檢測(cè)ACE的活性；利用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（Angiotensin-convertingenzymeinhibitors，ACEI）類藥物—卡托普利（captopril）對(duì)ACE活性的抑制作用對(duì)所得細(xì)胞株進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果：①利用RT-PCR法成功獲得大鼠ACEcDNA，重組真

5、核表達(dá)載體經(jīng)EcoRI酶切鑒定、測(cè)序及BLAST分析證實(shí)得到正確的重組pEGFP-ACE質(zhì)粒。
　　②電轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞48h后，Westernblot鑒定重組ACE蛋白在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)，在約180KD處出現(xiàn)條帶，并篩選得到穩(wěn)定表達(dá)ACE的細(xì)胞株。
　?、劾肏PLC法證實(shí)過(guò)表達(dá)ACE的細(xì)胞株對(duì)HHL的催化分解作用與HepG2細(xì)胞相比有顯著差異；利用卡托普利對(duì)ACE活性的抑制作用，檢測(cè)結(jié)果顯示卡托普利對(duì)過(guò)表達(dá)ACE