外源KCS酶基因轉(zhuǎn)化富油新綠藻的初步研究.pdf

1、為了探討β-酮脂酰輔酶A合酶(KCS)在微藻超長(zhǎng)鏈脂肪酸合成調(diào)控中的作用，提高微藻中的超長(zhǎng)鏈脂肪酸的含量，本文以富油新綠藻(Neochlorisoleoabundans)為研究對(duì)象，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將銀扇草的KCS酶基因遺傳轉(zhuǎn)化到微藻中，并對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果進(jìn)行分析，對(duì)轉(zhuǎn)化后微藻油脂的脂肪酸組成進(jìn)行了分析檢測(cè)，對(duì)轉(zhuǎn)化KCS基因?qū)φ{(diào)控微藻脂肪酸組成的作用進(jìn)行了分析。本文是首次以富油新綠藻為工作對(duì)象的基因工程研究，實(shí)現(xiàn)了外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化，此項(xiàng)

2、工作為富油新綠藻的進(jìn)一步基因工程研究打下了基礎(chǔ)。本文的主要內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　(1)研究了富油新綠藻對(duì)五種抗生素的敏感性。分別在液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)條件下，研究了富油新綠藻對(duì)氯霉素、青霉素、鏈霉素、四環(huán)素、潮霉素五種抗生素的敏感性。結(jié)果表明，在液體培養(yǎng)條件下，鏈霉素和潮霉素在濃度為10μg/mL時(shí)可以完全抑制藻細(xì)胞的生長(zhǎng)，氯霉素和四環(huán)素在濃度為100μg/mL時(shí)表現(xiàn)出抑制作用，青霉素在500μg/mL才表現(xiàn)出輕微的抑制作用。固體培

3、養(yǎng)條件的研究結(jié)果與液體培養(yǎng)條件的結(jié)果基本一致。
　　(2)成功構(gòu)建了2個(gè)用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化的雙元表達(dá)載體。以農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化常用的質(zhì)粒載體pCAMBIA1301-為基礎(chǔ)，分別以花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子CaMV35S和萊茵衣藻偏好的融合啟動(dòng)子Hsp70A/Rbcs2構(gòu)建KCS基因的表達(dá)盒，得到2個(gè)表達(dá)載體pCAMBIA1301-KCS、pCAMBIA1301-Rbcs2-KCS。同時(shí)，這兩個(gè)載體還含有β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因和潮霉

4、素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hpt)作為報(bào)告基因和篩選標(biāo)記基因。
　　(3)通過(guò)攜帶重組質(zhì)粒載體的農(nóng)桿菌與富油新綠藻細(xì)胞共培養(yǎng)的方法，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因向富油新綠藻的遺傳轉(zhuǎn)化。首先，通過(guò)電轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，挑選出成功攜帶重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株。然后，將攜帶重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌與富油新綠藻共培養(yǎng)，使重組質(zhì)粒中的T-DNA轉(zhuǎn)入富油新綠藻基因組。最后，以含潮霉素10μg/mL的培養(yǎng)基平板對(duì)與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后的藻細(xì)胞做篩選培養(yǎng)，得到在篩選平板上生長(zhǎng)的獲