新型信號增強型納米免疫傳感器的構建和對四種肺癌標志物的檢測研究.pdf

1、肺癌死亡率居各類惡性腫瘤之首,是對人類健康危害最大的惡性腫瘤之一。世界衛(wèi)生組織預測,到2025年中國每年將有超過一百萬新發(fā)肺癌病例。早發(fā)現(xiàn)早治療對延長惡性腫瘤患者生存期有積極作用,研究有效的肺癌早期診斷方法和技術對肺癌的防控有重要意義。血清中腫瘤標志物的存在或量變可以提示腫瘤性質的變化,用以輔助腫瘤診斷、分類、預后判斷及治療指導,具有高效、靈敏、創(chuàng)傷小、標本易獲取等優(yōu)點,是腫瘤早期診斷的重要指標。目前,臨床用于檢測的肺癌標志物均為腫瘤相

2、關標志物,且單一腫瘤標志物往往局限臨床診斷,多腫瘤標志物聯(lián)合檢測可顯著提高診斷靈敏度、特異度和準確度。通過腫瘤標志物蛋白芯片對肺癌患者及健康體檢者血清中的腫瘤標志物水平做相關回顧性分析,發(fā)現(xiàn)糖類抗原19-9(carbohydrateantigen19-9,CA19-9),癌胚抗原(carcinoembryonicantigen,CEA),糖類抗原125(carbohydrateantigen125,CA125),糖類抗原15-3(car

3、bohydrateantigen15-3,CA15-3),神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuronspecificenolase,NSE)等腫瘤標志物與肺癌呈較高的相關性。其中,CA19-9、CA15-3、CEA、CA125等4種標志物的聯(lián)合檢測可顯著增加肺癌診斷的特異度和準確度。因此,發(fā)展四種標志物聯(lián)合檢測的高靈敏免疫傳感技術,有望輔助提高肺癌早期診斷率,對肺癌的防控及療效評估有重要的臨床價值。
　　電致化學發(fā)光(ECL)是將電化學與

4、化學發(fā)光相結合,通過電化學反應產生氧化還原激發(fā)態(tài),激發(fā)態(tài)物質自身或與體系其他共存物質之間反應而產生的化學發(fā)光現(xiàn)象。電致化學發(fā)光量程寬,不同發(fā)光探針激發(fā)電位間隔寬,不互相干擾,可在同一單電極界面上對多種發(fā)光信號同時檢測。將免疫分析技術與電致化學發(fā)光或電化學傳感技術相結合,構建電致化學發(fā)光或電化學免疫傳感器,有望實現(xiàn)快速、便攜的多標志物聯(lián)合檢測,對提高肺癌早期診斷率有著至關重要的意義。納米材料具有特殊的物理化學性能及生物兼容性,既可用于固定

5、或標記抗體,也可增強導電性和催化光量子反應從而增強ECL和電化學信號,廣泛地應用在ECL和電化學免疫分析領域。生物酶可通過與底物的反應,催化放大檢測信號提高檢測靈敏度,其在電化學免疫分析中應用較廣,但在ECL免疫分析中應用較少。將納米材料與生物酶結合,通過協(xié)同催化作用,能呈現(xiàn)出幾何倍數(shù)級的催化反應效率,以此構建免疫傳感器,能明顯放大檢測信號,提高檢測靈敏度,有利于惡性腫瘤產生初期低濃度水平腫瘤標志物的高靈敏檢出,有助于肺癌等惡性腫瘤的早

6、發(fā)現(xiàn)、早診斷。
　　本研究首先通過統(tǒng)計分析C-12蛋白芯片對1848例肺癌及非腫瘤患者腫瘤標志物的檢測結果,并結合臨床資料進行回顧性研究,找出與肺癌呈顯著相關性的4項腫瘤標志物,分析其聯(lián)合檢測的特異度、靈敏度和準確度。然后,以這4種腫瘤標志物為免疫檢測標志物模型,將納米技術、酶免疫技術、電致化學發(fā)光、電化學分析技術相結合用于構建電致化學發(fā)光和電化學免疫傳感器,并初步探索用于腫瘤標志物聯(lián)合檢測的免疫傳感分析。實驗分別基于NADH酶交

7、聯(lián)納米銀的納米復合物催化放大聯(lián)吡啶釕ECL信號,HRP酶與底物H2O2的催化反應放大K2S2O8的ECL信號,采用夾心法和直接法兩種免疫模式,構建針對CA125和CEA超靈敏檢測的電致化學發(fā)光免疫傳感器。同時,以具有一定電位間隔的電化學探針分別摻雜納米TiO2,標記anti-CA19-9和anti-CA15-3兩種抗體,采用夾心免疫識別模式,構建雙組分聯(lián)合同時檢測的電化學免疫傳感器。
　　研究目的：
　　1.肺癌相關性腫瘤標

8、志物在不同病理類型肺癌中的表達及其臨床意義,篩選出與肺癌相關性較高,且適用于肺癌早期診斷的聯(lián)合檢測用腫瘤標志物。
　　2.利用還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸輔酶(NADH)和銀納米顆粒(nano-Ag)的協(xié)同催化作用,增強電致化學發(fā)光(ECL)免疫檢測信號,構建超靈敏的ECL免疫傳感器,檢測血清中腫瘤標志物CA125的表達水平。
　　3.將酶與底物的循環(huán)催化應用到電致化學發(fā)光檢測中,利用過氧化氫酶(HRP)與H2O2底物反應催化

9、過硫酸根離子(S2O82-)的陰極電致化學發(fā)光信號,建立基于酶催化的非標記型ECL免疫傳感器,檢測血清中腫瘤標志物CEA的表達水平。
　　4.初步探討同界面多標記的多組分免疫檢測技術,利用不同探針分子摻雜Nafion@TiO2復合納米顆粒,陽離子交換標記糖類蛋白抗體,建立一種可同步檢測肺癌患者血清中CA19-9和CA15-3兩種腫瘤標志物的免疫傳感器。
　　研究內容和方法：
　　1.四種腫瘤標志物在不同病理類型肺癌中的

10、表達及其臨床意義
　　用蛋白芯片法檢測肺癌組1021例及健康體檢者827人血清中CA19-9、CEA、CA125及CA15-3的表達水平,并結合臨床資料進行回顧性研究,分析不同病理類型
　　2)不同病理類型肺癌中血清腫瘤標志物陽性率比較:1021例肺癌患者,按病理分型,腺癌392例(38.39％)、鱗癌386例(37.80%)、小細胞肺癌243例(23.80%)。非小細胞肺癌患者血清腫瘤標志物CA19-9、CEA、CA125

11、及CA15-3的陽性率均明顯高于小細胞肺癌,差異有統(tǒng)計學意義。CEA陽性率在腺癌患者血清中最高(達55.35%),明顯高于鱗癌組的陽性率(26.68%)和小細胞肺癌組的陽性率(25.92%);CA125次之,在腺癌患者血清中達41.07%,明顯高于鱗癌組的陽性率(27.72%)和小細胞肺癌組的陽性率(29.62%);CA19-9和CA15-3表達的陽性率在腺癌組明顯高于鱗癌組和小細胞肺癌組。
　　3)ROC曲線對四種腫瘤標志物鑒別

12、診斷不同病理類型肺癌的準確性評估:CA19-9對肺腺癌組的診斷準確性較高,ROC曲線下面積為0.617,并且以0.5為對照,有統(tǒng)計學意義;CEA對肺腺癌組及小細胞肺癌組的診斷準確性較好,ROC曲線下面積分別為0.697和0.446,有統(tǒng)計學意義;CA125對肺腺癌組及小細胞肺癌組診斷的準確性較高,其ROC曲線下面積下分別為0.600和0.440,有統(tǒng)計學意義;CA15-3對肺腺癌組診斷的準確性較高。
　　4)四種標志物在肺癌不同病

13、理類型診斷中的靈敏度和特異性:四種腫瘤標志物單項檢測時的靈敏度均不高,CEA(37.5%),CA125(33.3%),CA19-9(14.8%)、CA15-3(6.8%);四種標志物在不同病理類型肺癌的敏感性顯著不同(P<0.05),肺腺癌中的敏感性高于肺鱗癌和小細胞肺癌。
　　5)聯(lián)合檢測四種腫瘤標志物的臨床意義:以四種腫瘤標志物多種組合,以健康體檢組為對照,分別計算兩項組合、三項組合及四項組合的敏感性、特異性和準確性。兩項聯(lián)合

14、時,CEA+CA125聯(lián)合檢測的敏感性最高19.01%,其次是CA19-9+CEA組合為10.68%;三項聯(lián)合檢測時組合間敏感性差別不明顯;四項標志物聯(lián)合檢測時,靈敏度僅為1.96%。聯(lián)合檢測時,隨著檢測項目的增加,敏感性降低,但特異性均在98%以上,四項聯(lián)合檢測時,對肺癌診斷具有最高的特異性達100%。
　　2.基于還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸輔酶(NADH)和銀納米顆粒(nano-Ag)協(xié)同催化的信號增強型電致化學發(fā)光(ECL)

15、免疫傳感器研究
　　1)該ECL免疫傳感器對CA125檢測的線性范圍為0.1-150U/mL,檢測限為0.03U/mL。且對比實驗顯示金屬-有機酶復合納米材料協(xié)同催化,比任何單一組分對ECL信號的增強程度都要大。
　　2)該免疫傳感器具有良好的特異性、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。
　　3)對比目標免疫傳感器和ELLSA法對腫瘤患者和健康人群血清樣本中的CA125檢測結果,顯示目標免疫傳感器對血清中CA125抗原檢測與ELLSA法檢

16、測結果有一致性,且目標免疫傳感器有更低的檢測下限,能初步應用于血清中CA125抗原檢測。
　　3.過氧化氫酶催化過硫酸鉀(S2O82-)陰極電致化學發(fā)光構建非標記型免疫傳感器對腫瘤標志物CEA的檢測
　　1)酶催化可顯著放大S2O82-的陰極ECL信號,以直接免疫法,構建非標記型免疫傳感器對CEA抗原檢測,檢測限可達1.04ng/mL。
　　2)該免疫傳感器具有良好的選擇性和特異性。
　　3)與前期工作相比,本研

17、究成功將酶聯(lián)免疫技術應用于ECL免疫分析中,可提高ECL免疫檢測靈敏度,用于痕量腫瘤標志物檢測。
　　4.探針分子摻雜Nafion@TiO2復合納米顆粒陽離子交換標記糖類蛋白的雙組分同步電化學免疫測定CA19-9和CA15-3
　　1)以Nafion@TiO2復合納米顆粒為載體,通過陽離子交換標記,將不同電化學探針標記于不同糖類蛋白抗體上,避免共價標記對抗體活性的影響。
　　2)基于上述標記抗體,成功實現(xiàn)對CA19-9

18、和CA15-3兩種糖類蛋白標志物的電化學聯(lián)合測定。目標免疫傳感器對CA19-9的檢出限為1.6U/mL,對CA15-3的檢出限為0.3U/mL。
　　3)將該免疫傳感器用于人血清中CA19-9和CA15-3的加標回收測定,結果表明該免疫傳感器對雙組分抗原具有較好的雙組分同步檢測特異性和重現(xiàn)性。
　　結論：
　　1.四種腫瘤標志物在不同病理類型肺癌中的表達及其臨床意義
　　CA19-9、CEA、CA125及CA15

19、-3四種腫瘤標志物對肺腺癌診斷的準確性較高,多項聯(lián)合檢測能明顯增加診斷的特異性,研究針對這類標志物聯(lián)合檢測的免疫傳感器,有利于早期肺癌的快速發(fā)現(xiàn)和診斷,對肺癌防控有重要意義。
　　2.基于還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸輔酶(NADH)和銀納米顆粒(nano-Ag)協(xié)同催化的信號增強型電致化學發(fā)光(ECL)免疫傳感器研究
　　成功研制一種基于金屬-有機酶復合納米材料標記的ECL免疫傳感器,使用夾心免疫分析模式,實現(xiàn)對人體血清中CA

20、125的測定。該方法將金屬與有機酶的協(xié)同催化作用,應用到ECL信號放大中,提高了ECL免疫分析靈敏度,為臨床檢測用ECL傳感器發(fā)展打下基礎。
　　3.過氧化氫酶催化過硫酸鉀(S2O82-)陰極電致化學發(fā)光構建非標記型免疫傳感器對腫瘤標志物CEA的檢測
　　成功研制了一種非標記型的ECL酶聯(lián)免疫技術,用于構建針對腫瘤標志物CEA檢測的免疫傳感器,該免疫傳感器利用酶催化陰極電致化學發(fā)光,并用于對血清中痕量CEA檢測,為臨床腫瘤標