PGRN和IL-12家族在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血中的表達(dá)及意義.pdf

1、第一部分、PGRN在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的表達(dá)及其與疾病活動性的關(guān)系
　　研究背景：
　　系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)是一種多發(fā)于孕齡期婦女的自身免疫性疾病，常累及機(jī)體多個(gè)組織器官，發(fā)病原因至今不明。SLE的病理特點(diǎn)是多種自身抗體的過量表達(dá)和大量免疫復(fù)合物的沉積。由于SLE累及多個(gè)系統(tǒng)和器官，因此患者的生活質(zhì)量受到很大影響。在SLE患者機(jī)體中，促炎性細(xì)胞因子和抑炎性細(xì)胞因子的

2、分泌過量調(diào)控紊亂，最終導(dǎo)致了機(jī)體組織和器官的炎癥反應(yīng)及損傷。顆粒蛋白前體(Progranul in，PGRN)也稱之為顆粒蛋白-上皮素前體(granulin-epithel in precursor，GEP)，前列腺癌細(xì)胞衍生生長因子(prostatic cancer-cell derived growth factor，PCDGF)，上皮素前體(proepithelin)等，由顆粒體蛋白(granul in，GRN)基因編碼，是一種具

3、有多種生物學(xué)功能的自分泌因子。PGRN大量表達(dá)于淋巴細(xì)胞，神經(jīng)元，免疫細(xì)胞，增殖活躍的上皮細(xì)胞和軟骨細(xì)胞中。諸多研究發(fā)現(xiàn)，PGRN在多種生理性和病理性過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。例如胚胎的早期發(fā)育，創(chuàng)傷愈合和組織重構(gòu)，炎癥反應(yīng)，免疫反應(yīng)等。PGRN也是一個(gè)重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，有研究發(fā)現(xiàn)GRN基因變異引起的PGRN蛋白的部分丟失可導(dǎo)致額顳葉癡呆。此外PGRN也是一個(gè)參與了軟骨發(fā)育和降解的重要調(diào)節(jié)因子。Tang W等報(bào)道發(fā)現(xiàn)PGRN與腫瘤壞死

4、因子(tumor necrosis factor，TNF)受體結(jié)合，阻斷TNF-α的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而明顯拮抗膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠模型的關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)。因此，PGRN可能是未來治療自身免疫性疾病的新靶點(diǎn)。然而，PGRN在SLE患者中的表達(dá)至今未有報(bào)道。糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid，GC)是治療SLE的常用藥物，通過基因組途徑和非基因組途徑抑制許多因子的表達(dá)和功能。但是糖皮質(zhì)激素是否對PGRN的表達(dá)有影響尚未明確。
　　基于上述

5、觀點(diǎn)，我們在此項(xiàng)研究中檢測了SLE患者及健康對照人群外周血中PGRN，IL-6，蛋白酶3(proteinase3，PR3)，TNFR，TNF-α的表達(dá)濃度及mRNA的表達(dá)水平，及抗dsDNA抗體的血清濃度，以探討PGRN在SLE患者中的作用及其與疾病活動性的關(guān)系。此外，還觀察了糖皮質(zhì)激素對PGRN表達(dá)水平的影響。
　　研究方法:
　　1.研究對象
　　篩選30例新診斷的SLE患者進(jìn)入實(shí)驗(yàn)組，他們?nèi)糠?997年美國風(fēng)

6、濕病學(xué)院修訂的SLE的分類標(biāo)準(zhǔn)。所有實(shí)驗(yàn)組患者的SLEDAI(systemic lupuserythematosus disease activity index)評分≥10，入組前都未接受糖皮質(zhì)激素及其它免疫抑制劑的治療，并在用藥前采集第一次外周血樣。入組后所有患者均接受了糖皮質(zhì)激素治療，即潑尼松1 mg/kg/day。連續(xù)給予潑尼松3周后再次采集外周血樣。選取30例性別年齡匹配的來我院查體的健康人進(jìn)入對照組。所有研究對象均簽署了山東

7、大學(xué)齊魯醫(yī)院臨床倫理委員會的知情同意書。
　　2.實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）分析各細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)
　　在實(shí)驗(yàn)組SLE患者接受潑尼松治療的前后分別收集5ml外周抗凝血，用紅細(xì)胞裂解液提取外周血中的單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PMBC)，根據(jù)說明書用Trizol法提取PMBCs的總RNA。核酸蛋白測定儀初步測定RNA的濃度并標(biāo)準(zhǔn)化至1 ug/ml以利于接下來的

8、反轉(zhuǎn)錄步驟。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取cDNA后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測PMBCs中PGRN的mRNA的表達(dá)水平。
　　3.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測外周血清細(xì)胞因子的濃度
　　在實(shí)驗(yàn)組SLE患者接受潑尼松治療前后分別收集5ml外周自凝血，凝固后離心分離出血清，儲存在-80℃條件下。按照說明書用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）檢測血清中PGRN，IL-6，PR3，TNFR和

9、抗dsDNA抗體的血清濃度。
　　4.統(tǒng)計(jì)分析
　　用SPSS17.0軟件進(jìn)行結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)用中位數(shù)±四分位距表示。PGRN的分布為非正態(tài)分布，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。糖皮質(zhì)激素治療前組和治療后組數(shù)據(jù)的分析采用兩個(gè)相關(guān)樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組和對照組之間的數(shù)據(jù)分析采用兩個(gè)獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)。PGRN與IL-6，PR3，TNFR，TNF-α及抗dsDNA抗體之間的關(guān)系用斯皮爾曼等級相關(guān)進(jìn)行分析。認(rèn)為P＜0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

10、義。
　　研究結(jié)果：
　　1.研究對象的臨床特點(diǎn)
　　實(shí)驗(yàn)組的30例SLE患者中，男性7例，女性23例，年齡12-52歲，平均28.4±9.3歲。病程1-37月，平均12.6±10.1個(gè)月。實(shí)驗(yàn)組患者的SLEDAI評分，治療前范圍10-23分，平均15.1±3.8分，治療后范圍是6-22分，平均12.2±4.0分。對照組包括女性23例，男性7例，年齡在18-59歲之間，平均30.1歲。
　　2.SLE患者外周血清

11、中PGRN水平升高
　　治療前SLE患者外周血清中PGRN（17.82±5.18，p＜0.01），IL-6(1.56±1.18,p＜0.01), TNFR(17.50±10.33, p＜0.01), TNF-α(89.59±20.27, p＜0.01), PR3(49.33±18.85,p＜0.01)和dsDNA抗體(208.19±194.24，p＜0.01)的濃度均高于正常對照組。在SLEDAI評分≥10的SLE患者中，PGRN

12、外周血清濃度顯著升高(p＜0.05)。治療后SLE患者與治療前SLE組相比，外周血清中PGRN濃度顯著下降(13.64±4.51，p=0.002)。治療后SLE患者外周血清中PGRN濃度顯著仍高于對照組人群(11.09±1.62，p=0.002)。總之，無論是治療前還是治療后SLE患者外周血清中PGRN的表達(dá)均高于正常對照人群。治療后SLE患者外周血清中IL-6(0.97±0.37,p=0.001),TNFR(10.61±3.70,p=

13、0.025)和TNF-α(54.31±17.17,p=0.012),PR3(48.25±10.89，p＜0.01)濃度均高于對照組人群。治療前IL-6，TNFR和TNF-α，濃度高于治療后SLE患者(p＜0.05)。PR3在治療前和治療后SLE患者中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。
　　3.SLE患者PMBCs中PGRN mRNA高表達(dá)
　　我們用與內(nèi)參基因GAPDH比較后的倍數(shù)表示PGRNmRNA表達(dá)水平的變化。與

14、對照組相比，治療前SLE患者PGRN mRNA表達(dá)相對數(shù)值升高了4.4倍(P＜0.01)（圖1）。治療后SLE患者與治療前相比，PGRN mRNA表達(dá)相對數(shù)量下降了1.34倍(P＜0.05)。
　　4.激素治療下調(diào)SLE患者的PGRN及其它炎癥因子的表達(dá)水平
　　在實(shí)驗(yàn)組中，經(jīng)過GC治療后，外周血清中PGRN(13.64±4.51，P=0.02)， IL-6(0.97±0.37,P=0.022), TNFR(10.61±3.

15、70,P=0.003), TNF-α(54.31±17.17,P=0.001)和anti-dsDNA抗體(137.02±80.71，P=0.038)的濃度明顯下降。但是PR3無明顯變化(48.25±10.89，P=0.549)。治療后SLE患者與治療前相比，PGRN mRNA表達(dá)相對數(shù)量下降了1.34倍(P＜0.05);同時(shí)IL-6(P＜0.05)TNF-α(P＜0.05) and TNFR(＜0.05) mRNA表達(dá)亦明顯下降。

16、>　　5.SLE患者PGRN與其它炎癥反應(yīng)因子的關(guān)系
　　為了明確在SLE患者中PGRN表達(dá)水平與炎癥反應(yīng)因子之間的關(guān)系，我們用斯皮爾曼等級相關(guān)分析了PGRN與IL-6，TNFR，TNF-α，PR3和抗dsDNA抗體之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，治療前的SLE患者外周血清PGRN水平與IL-6(r=0.790,P＜0.01), TNFR(r=0.559,P=0.01), TNF-α(r=0.438,P=0.015)和抗dsDNA抗體(r

17、=0.906，P＜0.01)具有顯著相關(guān)性。經(jīng)過GC治療后，PGRN濃度仍與IL-6(r=0.836,P＜0.01), PR3(r=0.396,P=0.031), TNFR(r=0.533,p=0.02),TNF-α(r=0.378，P=0.039)和抗dsDNA抗體(r=0.712，P＜0.01)顯著相關(guān)。但是治療前組中，PGRN與PR3的濃度無顯著相關(guān)性(r=0.298，P=0.110)。
　　結(jié)論：
　　我們檢測了PG

18、RN在SLE患者外周血中的表達(dá)水平，初步探討了PGRN在SLE的表達(dá)及意義。本研究結(jié)果得到以下的結(jié)論:(1).PGRN在活動性及穩(wěn)定性SLE患者的外周血清中濃度顯著高于健康對照人群，PMBC的mRNA的表達(dá)亦高于健康對照人群;(2).PGRN的受體TNFR，PR3，IL-6，TNF-α及抗dsDNA抗體在活動性狼瘡患者中均高表達(dá);(3).無論在治療前還是治療后SLE患者中PGRN的濃度與IL-6及抗dsDNA抗體濃度線性相關(guān);(4).糖

19、皮質(zhì)激素可顯著降低PGRN在SLE患者中的表達(dá)?？傊?，PGRN參與了SLE的發(fā)生發(fā)展過程，且濃度的高低與SLE的疾病活動性相關(guān)。我們認(rèn)為PGRN作為TNF/TNFR的拮抗劑，可能是將來治療SLE的一個(gè)強(qiáng)有力的新靶點(diǎn)。
　　第二部分、糖皮質(zhì)激素下調(diào)系統(tǒng)性紅斑狼瘡IL-12家族因子的表達(dá)
　　研究背景：
　　系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)是一種多態(tài)性的自身免疫性疾病今病因

20、不明。SLE多發(fā)生在20歲到40歲之間的婦女。SLE發(fā)病的病理特點(diǎn)是自身抗體的高表達(dá)和免疫復(fù)合物的沉積，常常累及機(jī)體的多個(gè)系統(tǒng)和器官。SLE的病因不明，其發(fā)病和遺傳，環(huán)境的相互作用有關(guān)。自身免疫耐受平衡的打破導(dǎo)致了自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展，SLE也不例外。 IL-12家族包括IL-12，IL-23，IL-27和IL-35，它們都是異二聚體，具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的多種生物學(xué)功能。IL-12是由p35和p40兩個(gè)亞單位組成的異二聚體，對于Th1

21、細(xì)胞的分化至關(guān)重要。IL-23由p40和p19兩個(gè)亞單位組成。IL-12和IL-23是促炎癥反應(yīng)因子，分別調(diào)節(jié)Th1和Th17細(xì)胞的發(fā)育。IL-27由EBI-3和p28兩個(gè)亞單位組成，起初被認(rèn)為是促炎癥反應(yīng)因子，最近發(fā)現(xiàn)它是一個(gè)免疫調(diào)節(jié)因子。IL-35是近年分離出的新的IL-12的家族成員，由EBI-3和p35組成，是強(qiáng)有力的抑炎因子，由胸腺來源的自然調(diào)節(jié)T細(xì)胞產(chǎn)生。糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoids，GCs)是強(qiáng)有力的抗炎和抑

22、制免疫藥物，廣泛應(yīng)用于治療SLE，皮肌炎等自身免疫性疾病。糖皮質(zhì)激素抑制白細(xì)胞向炎癥反應(yīng)部位遷移并通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)破壞白細(xì)胞，成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的功能;可以明顯減少促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，例如IL-2，IL-6，TNF-α和前列腺素(prostaglandins，PGs)。目前IL-12，IL-23，IL-27和IL-35在SLE患者疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用未知。在本研究中我們將探討這些因子在SLE患者中的表達(dá)及糖皮質(zhì)激素治療對它們的影

23、響。
　　研究方法:
　　1.研究對象
　　篩選30例新診斷的且SLEDAI(systemic lupus erythematosus diseaseactivity index)評分≥i0的SLE患者進(jìn)入實(shí)驗(yàn)組。他們的診斷均符合1997年美國風(fēng)濕病學(xué)院修訂的SLE的分類標(biāo)準(zhǔn)。所有的實(shí)驗(yàn)組患者入組前都未接受糖皮質(zhì)激素及其它免疫抑制劑的治療。入組后所有患者均接受了激素治療，即潑尼松1 mg/kg/day。連續(xù)給予潑尼松2

24、周后再次采集外周血樣。對照組包括30例年齡性別相匹配的健康成年人。所有研究對象均簽署了山東大學(xué)齊魯醫(yī)院臨床倫理委員會的知情同意書。
　　2.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測外周血清IL-12家族各因子的濃度
　　在激素治療前后分別收集5ml外周血，凝固后離心取得血清，儲存在-80℃條件下。按照說明書用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immuno sorbentassay，ELISA)檢測血清中IL-12， IL-23， I

25、L-27， IL-35， IL-6和抗dsDNA抗體血清濃度。
　　3.統(tǒng)計(jì)分析
　　用SPSS17.0軟件進(jìn)行結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)用中位數(shù)±四分位距表示。糖皮質(zhì)激素治療前組，治療后組和對照組之間的數(shù)據(jù)分析采用非參數(shù)檢驗(yàn)。IL-12家族各因子與IL-6和抗dsDNA抗體之間的關(guān)系用斯皮爾曼等級相關(guān)進(jìn)行分析。認(rèn)為P＜0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果：
　　1.研究對象的臨床特點(diǎn)
　　實(shí)驗(yàn)組的30例S

26、LE患者中，男性7例，女性23例，年齡13-52歲，平均28.4±9.4歲。病程1-37月，平均12.9±10.1個(gè)月。實(shí)驗(yàn)組患者的SLEDAI評分，治療前范圍10-23分，平均15.2±3.8分，治療后范圍是6-22分，平均12.4±4.0分。
　　2.SLE患者外周血清中IL-12家族各因子水平升高，糖皮質(zhì)激素治療后下降
　　結(jié)果顯示，治療前SLE患者外周血清中IL-12，IL-23，IL-27，IL-35，IL-6和抗

27、dsDNA抗體的濃度均高于正常對照組(p＜0.05)。治療后，IL-12， IL-23，IL-27，IL-35，IL-6和抗dsDNA抗體的濃度明顯下降，且IL-23，IL-27，and IL-35的水平與正常對照組無顯著差異。
　　3.SLE患者IL-12，IL-23，IL-27，IL-35與IL-6和抗dsDNA抗體的關(guān)系
　　結(jié)果顯示，治療前的SLE患者外周血清IL-12水平與IL-6(r=0.897，P＜0.01)，

28、和抗dsDNA抗體((r=0.607，P＜0.01)具有顯著相關(guān)性。經(jīng)過GC治療后，IL-12濃度仍與IL-6(r=0.897，P＜0.01)和抗dsDNA抗體((r=0.651，P＜0.01)顯著相關(guān)。此外IL-23，IL-27，IL-35的水平分別與IL-6和抗dsDNA抗體水平呈顯著相關(guān)性。
　　結(jié)論：
　　我們的研究顯示，IL-12家族各因子在SLE患者中高表達(dá)。IL-12與IL-23與疾病的活動性相關(guān)。因此我們需要