多重耐藥鮑曼不動桿菌臨床株與RND型和MATE型外排泵的研究.pdf

1、目的：鮑曼不動桿菌的耐藥性近年呈現逐漸上升的趨勢，給臨床治療帶來嚴峻挑戰(zhàn)。主動外排泵與細菌耐藥密切相關。本試驗采用分子生物學方法研究鮑曼不動桿菌臨床株的多重耐藥表型、泵抑制劑的干預作用及主動外排系統(tǒng)：RND型外排泵AdeABC、AdeIJK和MATE型外排泵AbeM的泵基因攜帶、表達及外排泵AdeABC的調控系統(tǒng)AdeRS的基因序列變化情況，為指導臨床合理使用抗菌藥物、減少細菌耐藥性的出現或傳播、新型抗菌藥物的研制提供依據。 方

2、法： 1、菌株收集、藥敏試驗與泵抑制劑干預試驗：收集自2006年1月至2008年6月期間天津市3家三級甲等醫(yī)院臨床分離的鮑曼不動桿菌共35株，其中多重耐藥株30株，敏感株5株。采用微量肉湯稀釋法和瓊脂紙片擴散法測定臨床菌株對13種常用抗菌藥物（哌拉西林、頭孢氨噻肟、頭孢哌酮、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟、頭孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星、慶大霉素、亞胺培南、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星）的MIC值，分析耐藥率。采用微量肉湯稀釋法測定

3、未加用和加用泵抑制劑CCCP時菌株對8種抗菌藥物（左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、氯霉素、慶大霉素、阿米卡星、頭孢他定、頭孢哌酮/舒巴坦）的MIC值，分析泵抑制劑對菌株耐藥表型的影響。 2、RND型外排泵AdeABC、AdeIJK和MATE型外排泵AbeM的泵基因檢測及mRNA的表達：應用聚合酶鏈式反應（PCR）擴增全部實驗菌株的adeB、adeJ和abeM基因，選擇10株多重耐藥株和5株敏感株進行RT-PCR反應，以內參基因r

4、ecA為對照，進行凝膠掃描半定量分析。 3、RND型外排泵AdeABC的調控系統(tǒng)AdeRS的編碼基因檢測及序列分析：應用PCR方法擴增adeR和adeS基因，選擇2株多重耐藥株和2株敏感株的擴增產物測序，并與GenBank公布的序列進行比對分析。 結果： 1、藥敏試驗結果和泵抑制劑對耐藥表型的影響：30株多重耐藥的鮑曼不動桿菌臨床株對抗菌藥物的耐藥率為：環(huán)丙沙星（100％），氧氟沙星（100％），哌拉西林（100

5、％），頭孢噻肟（100％），頭孢他定（100％），頭孢哌酮（100％），頭孢曲松（100％），頭孢吡肟（100％），慶大霉素（100％），阿米卡星（100％），左氧氟沙星（50％），頭孢哌酮/舒巴坦（26．67％），亞胺培南（10％）。30株多重耐藥株在使用CCCP后均出現了對一種或一種以上抗菌藥物的MIC值較前下降4倍或4倍以上。5株敏感株在應用CCCP后，其中2株對氧氟沙星的MIC值較前下降2倍，1株對頭孢他定的MIC值較前下降2倍

6、，2株對慶大霉素的MIC值較前下降2-4倍。 2、外排泵基因檢測及mRNA的表達情況：30株多重耐藥株和5株敏感株均攜帶泵基因adeB、adeJ和abeM，10株多重耐藥株的adeB相對表達水平（灰度）為（1．211-9．169），而adeB基因在5株敏感株中均未檢測到mRNA表達；10株多重耐藥臨床株的adeJ相對表達水平（灰度）為（0．956-4．519），平均1．75；5株敏感株為（0．356-0．576），平均0．426

7、；abeM基因在10株多重耐藥株和5株敏感株中均未檢測到mRNA表達。 3、調控基因adeRS的檢測及序列比對：檢測2株敏感株AbS2與AbS5的adeR序列相同，與GenBank中公布的AY426969比對，同源性為97％。耐藥株AbM1與AbM4的adeR基因序列相同，與AY426969比對同源性為97％。AbM1、AbM4與AbS2、AbS5 adeR基因推導的氨基酸序列比對出現：Ile14→Val、Val120→Ile、

8、Ala136→Val。AbS2與AbS5的axles序列相同，與AY426969比對同源性為97％。AbM1與AbM4的adeS基因序列相同，與AY426969比對同源性為96％。AbM1、AbM4與AbS2、AbS5 adeS基因推導的氨基酸序列比對出現：Gly186→Val、Asn213→Asp，Ile285→Leu，Asn268→His，Val331→Ile，Val348→Ile、Gly356→Asn、His357→Asn，357

9、位后氨基酸缺失。 結論： 1、泵抑制劑CCCP的應用，可使鮑曼不動桿菌多重耐藥株對一種或多種抗菌藥物MIC值較前降低，這表明外排泵功能對鮑曼不動桿菌多重耐藥有一定貢獻。 2、RND型外排泵基因adeB和adeJ在10株多重耐藥株和5株敏感株中的表達差異，可能與鮑曼不動桿菌的多重耐藥有關。MATE型外排泵基因abeM在多重耐藥株和敏感株中均未檢測到mRNA的表達，有待擴大實驗例數進一步研究。 3、2株多重耐