丹皮酚對(duì)局灶性腦缺血的保護(hù)作用及對(duì)pAkt、Nrf2和HO-1調(diào)節(jié)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　 腦血管病是我國(guó)居民死亡和致殘的首位原因，以缺血性腦血管病最為常見。腦缺血后繼發(fā)損傷是一個(gè)復(fù)雜的病理級(jí)聯(lián)反應(yīng)，發(fā)病機(jī)制包括炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、Ca2+穩(wěn)態(tài)失調(diào)、細(xì)胞毒性作用等。氧化應(yīng)激廣泛存在于腦梗死后壞死和缺血區(qū)域，是導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷的主要因素。已有研究表明，大量氧自由基的產(chǎn)生會(huì)引起氧化應(yīng)激加劇脂質(zhì)，DNA等大分子物質(zhì)的損傷。腦作為人體耗氧量最大的器官，含有大量脂質(zhì)，對(duì)氧化應(yīng)激損傷最為敏感。如何減輕氧化應(yīng)激損傷已逐

2、漸成為臨床治療缺血性腦血管病的的熱點(diǎn)與重點(diǎn)。
　　 磷酸化的Akt可以有效影響腦梗死的病理進(jìn)展。絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt又名蛋白激酶B(Protein Kinase B，PKB)是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的一員，在一系列細(xì)胞凋亡、能量代謝、基因表達(dá)等過程中通過調(diào)節(jié)基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄基因發(fā)揮重要作用。Akt可以使轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2激活，在腦缺血后機(jī)體抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。
　　 轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(NF-E2 re

3、lated factor 2，Nrf2)是細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵因子及中樞調(diào)節(jié)者，通過與抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）相互作用，在自身防御機(jī)制中起著非常重要的作用。Nrf2通過誘導(dǎo)一系列抗氧化劑保護(hù)蛋白編碼，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)環(huán)境的條件調(diào)節(jié)，是細(xì)胞內(nèi)抗氧化應(yīng)激的重要通路。Nrf2/ARE信號(hào)通路可誘導(dǎo)多種化學(xué)保護(hù)Ⅱ相解毒酶、抗氧化酶，提高谷胱甘肽、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶及超氧化物

4、歧化酶等抗氧化物質(zhì)的表達(dá)。其中HO-1是重要的Ⅱ相解毒酶，是普遍存在的應(yīng)激蛋白，可以通過催化血紅素代謝為CO、鐵、膽綠素等發(fā)揮其強(qiáng)大的抗氧化能力。現(xiàn)HO-1已成為反映細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力的重要指標(biāo)。綜上所述，Nrf2信號(hào)的激活可以有效清除自由基等氧化物質(zhì)，維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原水平，發(fā)揮其重要的細(xì)胞保護(hù)作用。
　　 丹皮酚(Paeonol，PN)是從毛莨科植物牡丹根皮與蘿摩科植物徐長(zhǎng)卿干燥根或全草中提取的主要有效成分，是天然的抗氧化劑

5、，其藥理活性十分廣泛。大量實(shí)驗(yàn)研究表明丹皮酚通過發(fā)揮其抗炎、抗氧化作用在治療阿爾茲海默病、糖尿病、腫瘤等方面具有重要作用。除此之外，丹皮酚可以減少氧自由基，減輕氧化應(yīng)激改善D-半乳糖誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙?，F(xiàn)通過經(jīng)典pMCAO模型探究丹皮酚是否具有腦保護(hù)作用，以及其作用機(jī)制與phospho-Akt、Nrf2、HO-1、Claudin-5以及超氧化物岐化酶的活性是否相關(guān)。
　　 方法:
　　 實(shí)驗(yàn)分為兩部分:
　　 實(shí)驗(yàn)一

6、，丹皮酚的腦保護(hù)作用研究。
　　 實(shí)驗(yàn)二，丹皮酚治療組的phospho-Akt、Nrf2、HO-1的含量變化。
　　 實(shí)驗(yàn)一:采用成年健康雄性CD-1(ICR)小鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham）、單梗組(pMCAO)、溶劑對(duì)照組(Vehicle)、丹皮酚小劑量(30 mg/kg)組(PN-L)及丹皮酚大劑量(60 mg/kg)組(PN-H)。制作小鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞模型(middle cerebral artery w

7、as occluded，MCAO)。術(shù)前三天連續(xù)灌胃給藥，大腦中動(dòng)脈阻塞術(shù)前30分鐘再次灌胃給予丹皮酚溶液(30 mg/kg或60 mg/kg)，并于術(shù)后24小時(shí)進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，完畢后動(dòng)物斷頭處死，留取病變側(cè)腦組織采用干濕重法對(duì)腦含水量進(jìn)行測(cè)定，采用2％2，3，5-三苯基四唑氮紅(triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色測(cè)定腦梗死體積。
　　 實(shí)驗(yàn)二:采用成年健康雄性CD-1(ICR)小鼠，隨機(jī)

8、分為假手術(shù)組(Sham)、單梗組(pMCAO)、溶劑對(duì)照組(Vehicle)、丹皮酚小劑量(30 mg/kg)組(PN-L)及丹皮酚大劑量（60 mg/kg）組(PN-H)。干預(yù)組采取灌胃給藥。采用蛋白印跡法(Western Blot)測(cè)定pAkt、Nrf2、HO-1以及Claudin-5的蛋白水平，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qR-T PCR)測(cè)定Nrf2、HO-1以及Claudin-5的mRNA表達(dá)情況。應(yīng)用試劑盒檢測(cè)小鼠大腦皮層梗塞灶中

9、超氧化物岐化酶(SOD)的活性變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.采用6分法評(píng)價(jià)小鼠神經(jīng)功能行為學(xué)。評(píng)分于MCAO術(shù)后24 h進(jìn)行。PN-H組與Vehicle組相比，神經(jīng)功能缺損顯著改善(P＜0.05)。PN-L組雖較Vehicle組可降低評(píng)分，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.比較手術(shù)同側(cè)腦含水量。假手術(shù)組為79.08±0.78％，pMCAO組與Vehicle組相比，含水量相近差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Vehicle

10、組為84.61％±0.61％，與其相比，丹皮酚治療組腦組織含水量降低并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Vehicle vs.PN-L:84.61％±0.61％vs.82.16±1.02％;Vehicle vs.PN-H.84.61％±0.61％vs.81.68±1.23％)(P＜0.05)。比較手術(shù)對(duì)側(cè)腦含水量，5組基本相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 3.假手術(shù)組大腦皮層未見梗死灶。與溶劑對(duì)照組相比，PN大劑量組梗死體積明顯減小

11、(P＜0.05)，PN小劑量組雖可減小梗死體積，但與溶劑對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 4.丹皮酚對(duì)phospho-Akt、Nrf2、HO-1表達(dá)的影響:與Vehicle組相比，PN-L和PN-H兩組中的phospho-Akt、HO-1在蛋白水平的表達(dá)明顯增多(P＜0.05)，PN-H組Nrf2在細(xì)胞核內(nèi)積累增多(P＜0.05)，同樣，在PCR的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，丹皮酚大劑量組較溶劑對(duì)照組相比Nrf2，HO-1mR

12、NA表達(dá)水平也明顯升高(P＜0.05)。
　　 5.丹皮酚對(duì)Claudin-5表達(dá)的影響:與溶劑對(duì)照組相比，PN高劑量與低劑量組上調(diào)Claudin-5在蛋白水平表達(dá)，高劑量組亦可使Claudin-5mRNA表達(dá)增多。差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 6.丹皮酚對(duì)SOD的影響:相比于Sham組，小鼠腦缺血后梗塞灶皮層中超氧化物岐化酶(SOD)的活性反射性升高(P＜0.05)。丹皮酚干預(yù)后，SOD活性進(jìn)一步升高，

13、與Sham組、Vehicle組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 給予丹皮酚進(jìn)行早期腦梗死干預(yù)后，明顯降低腦水腫程度，減少梗死體積，改善神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分;進(jìn)一步的研究表明丹皮酚可上調(diào)了phospho-Akt、Nrf2、HO-1和Claudin-5的表達(dá)水平，增加SOD的活性，改善血腦屏障的通透性。對(duì)腦缺血后腦組織具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與激活A(yù)kt/Nrf2/HO-1通路有關(guān)，為丹皮酚臨床應(yīng)