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文檔簡介
1、背景:
腹瀉是嚴(yán)重危害人類健康的重要疾病之一,全球每年約有40億人次發(fā)病,并造成300~400萬患者死亡??v然很多治療措施和藥物已被采用,但在全球范圍內(nèi),腹瀉總體的發(fā)病率和死亡率未見明顯改善,即便在發(fā)達(dá)國家,兒童腹瀉也有較高的發(fā)病率和死亡率,因而尋求新的治療腹瀉藥物成為當(dāng)代研究的熱點(diǎn)。生理狀態(tài)下,腸道上皮細(xì)胞存在大量離子通道及轉(zhuǎn)運(yùn)體,維持腸道的吸收和分泌處于平衡狀態(tài)。但當(dāng)致瀉因素或物質(zhì),如細(xì)菌、病毒感染和毒素等作用于腸道時(shí),這
2、些離子通道及轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)和(或)活性就會(huì)發(fā)生改變,從而打破吸收和分泌間的平衡,造成大量的水電解質(zhì)丟失,嚴(yán)重者可導(dǎo)致患者死亡,因而腹瀉的本質(zhì)在于腸道分泌功能與吸收功能之間的平衡失調(diào)。在過去的幾十年中,科研工作者一直致力于尋找影響腸道吸收或分泌的藥物,小檗堿作為其中候選的一員,對(duì)霍亂毒素或致腸病性大腸桿菌引起的分泌性腹瀉具有良好的療效,提示小檗堿可能通過影響腸道的分泌或吸收來發(fā)揮治療腹瀉的作用。
小檗堿(berberine)是從黃
3、連、黃柏等多種植物中提取(或人工合成)的生物堿,具有廣泛的生物學(xué)作用,主要包括:抑制病原微生物的代謝,抑制腸液積聚及電解質(zhì)分泌,抑制炎癥反應(yīng),刺激膽汁及膽紅素分泌以及抑制快速性室性心律不齊等等,但最為主要的還是用于腹瀉的治療。在中國,小檗堿作為傳統(tǒng)中藥黃連素的主要成分,用于治療腹瀉已有數(shù)千年的歷史,但其作用機(jī)制目前還未完全闡明。既往研究認(rèn)為小檗堿主要通過抑菌作用來實(shí)現(xiàn)腹瀉的治療,但是僅僅抑菌作用并不能解釋全部,特別是分泌性腹瀉。在動(dòng)物模
4、型,小檗堿可以逆轉(zhuǎn)霍亂毒素引起的腹瀉,提示小檗堿能夠影響腸道的分泌與吸收。更為重要的是,小檗堿是目前中藥中為數(shù)不多的可以人工合成的小分子化合物。通過對(duì)其生物學(xué)活性及作用機(jī)制的進(jìn)一步探討,不僅有助于了解其分子機(jī)制和作用靶點(diǎn),而且可以通過建立的分子作用模型,為獲得更為高效的腹瀉治療藥物奠定基礎(chǔ)。
目的:
1.建立腹瀉模型,觀察小檗堿的治療效果2.研究小檗堿是否通過影響離子通道及轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)來達(dá)到治療腹瀉的效果3.初步探討
5、小檗堿影響離子通道及轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)的可能分子機(jī)制
方法:
1.將BALB/c小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、腹瀉組和小檗堿處理組,分別給予生理鹽水、20mg/kg番瀉苷A、以及20mg/kg番瀉苷A和80mg/kg小檗堿灌胃。計(jì)數(shù)灌胃后12h內(nèi)小鼠出現(xiàn)的腹瀉次數(shù)及小鼠的體重變化,觀察小檗堿的治療效果。2.刮取小鼠近端結(jié)腸上皮細(xì)胞,采用半定量RT-PCR檢測影響腸道吸收和分泌的主要離子通道:鈉-氫交換體家族(NHE1-NHE3)、
6、水通道蛋白家族(AQP4和AQP8)、AE1、CFTR、和SGLT1的表達(dá)變化。3.利用免疫組織化學(xué)的方法驗(yàn)證RT-PCR的結(jié)果。4.應(yīng)用RT-PCR和westernblotting方法在人腸上皮細(xì)胞(HIEC)中作進(jìn)一步證實(shí)。結(jié)果:
1.20mg/kg番瀉苷A灌胃1~1.5h后,所有小鼠均出現(xiàn)明顯的腹瀉癥狀,腹瀉癥狀約持續(xù)5~6h。在連續(xù)灌胃的7天中,腹瀉組小鼠出現(xiàn)消瘦、體重減輕癥狀,而對(duì)照組小鼠均未出現(xiàn)腹瀉、消瘦及體重減輕
7、的癥狀。通過計(jì)數(shù)灌胃后12h內(nèi)糊狀便及水樣便次數(shù),可發(fā)現(xiàn)腹瀉組小鼠出現(xiàn)糊狀便及水樣便的次數(shù)較對(duì)照組相比明顯增多(8.57±0.1VS0±0.0,p<0.05),差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.80mg/kg小檗堿灌胃后,腹瀉癥狀得到很好的控制,小檗堿處理組小鼠未出現(xiàn)腹瀉、消瘦及體重減輕的癥狀。連續(xù)灌胃7天,通過計(jì)數(shù)灌胃后12h內(nèi)糊狀便及水樣便次數(shù),可以發(fā)現(xiàn)小檗堿處理組小鼠出現(xiàn)糊狀便及水樣便的次數(shù)明顯少于腹瀉組(0.14±0.05VS8.57±0
8、.1,p<0.05),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.RT-PCR結(jié)果顯示NHE1、NHE2、NHE3、AQP4、AQP8、AE1、CFTR和SGLT1在小鼠近端結(jié)腸上皮細(xì)胞均存在一定程度的表達(dá)。與空白對(duì)照組小鼠相比,腹瀉組小鼠NHE1、NHE2、NHE3、AQP4、AQP8、CFTR和SGLT1的表達(dá)明顯下調(diào),而AE1的表達(dá)沒有顯著性變化。與腹瀉組小鼠相比,小檗堿處理組小鼠NHE2、NHE3、AQP4和AQP8的表達(dá)明顯上調(diào),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<
9、0.05),而NHE1、CFTR和SGLT1的表達(dá)沒有顯著性變化。4.免疫組化結(jié)果顯示NHE3和AQP4蛋白主要表達(dá)于近端結(jié)腸上皮刷狀緣,腹瀉組小鼠NHE3和AQP4蛋白呈少量表達(dá)乃至陰性表達(dá),而接受小檗堿處理的小鼠,其近端結(jié)腸上皮細(xì)胞NHE3和AQP4蛋白呈中度表達(dá)。5.在人腸上皮細(xì)胞系HIEC,RT-PCR結(jié)果表明,與單用番瀉苷A處理相比,番瀉苷A和小檗堿共處理的HIEC細(xì)胞,其NHE3mRNA的表達(dá)水平上調(diào)了約2倍,同樣AQP4的
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