抗結(jié)核桿菌新型藥物靶點—莽草酸脫氫酶蛋白抑制劑的篩選及其抑菌作用評價.pdf

1、結(jié)核病是由結(jié)核分支桿菌引起的一種嚴重的人類傳染性疾病。近年來，耐藥結(jié)核桿菌的出現(xiàn)，尋找新型抗結(jié)核桿菌的藥物及控制結(jié)核病勢在必行。莽草酸途徑是細菌生長所必需而人類不存在的代謝途徑，因此成為篩選新型抗微生物藥物的潛在作用靶標(biāo)。本研究對該代謝途徑的關(guān)鍵酶-莽草酸脫氫酶基因進行克隆、表達以及酶學(xué)性質(zhì)分析，并篩選該蛋白的抑制劑及探索這些小分子化合物對結(jié)核桿菌的抑制作用。 1、論文的第二章，對結(jié)核分支桿菌基因組中編碼莽草酸脫氫酶基因(aro

2、E)進行克隆，并表達純化了該蛋白。通過對編碼莽草酸脫氫酶基因進行序列分析，發(fā)現(xiàn)莽革酸脫氫酶基因序列中具有G-X-(N/S)-V-(T/S)-X-P-X-K模式序列，該序列是莽草酸脫氫酶家族中高度保守模式。利用園二色儀對重組莽革酸脫氫酶蛋白進行二級結(jié)構(gòu)測定，該重組蛋白中含有a-helix，β-sheet,β-turn，和randomcoil分別為29.2％，9.3％，32.7％，和28.8％。酶活性質(zhì)分析表明該重組莽草酸脫氫酶發(fā)揮酶活效應(yīng)

3、的最適pH值為9.0-12，最適溫度為63℃。以莽草酸為底物的Km值為29.5μM，NADP為底物的Km值為63μM。二價金屬離子Ni2+，Zn2+andMg2+對重組蛋白酶活性有較弱的增強作用。莽草酸脫氫酶酶學(xué)性質(zhì)的研究為以該酶作為抗結(jié)核桿菌藥物靶標(biāo)篩選抑制劑和新型藥物奠定基礎(chǔ)。 2、論文的第三章，介紹了針對莽草酸脫氫酶的虛擬篩選工作。在工作中，首先采用蛋白質(zhì)三維模建的方法，對結(jié)核桿菌的莽草酸脫氫酶進行結(jié)構(gòu)模擬，然后采用分子對

4、接方法對產(chǎn)生的數(shù)據(jù)庫進行搜索，篩選出可與該蛋白分子結(jié)合的小分子化合物82個。從酶學(xué)水平檢測這些小分子化合物對莽草酸脫氫酶活性的抑制作用，篩選出可有效抑制該酶活性的化合物20個，半數(shù)抑制濃度(IC50)結(jié)果表明有6種化合物的IC50小于100ug/ml，分別為83.947±4.373ug/ml，69.953±5.50ug/ml，96.953±5.50ug/ml，94.162±0.425ug/ml，95.949±1.54ug/ml。研究還發(fā)

5、現(xiàn)，蛋白與化合物預(yù)孵育時間對化合物的抑制作用有一定的影響，隨著孵育時間增加，抑制作用增強。 3、論文的最后部分，檢測了小分子化合物對培養(yǎng)中結(jié)核分枝桿菌H37Ra株的生長抑制作用，并初步檢測幾種小分子化合物對臨床分離的耐藥菌株的抑制作用。試驗結(jié)果表明：在82種化合物中，有22種化合物在200ug/ml的濃度下，可以完全抑制結(jié)核桿菌的生長。其中MIC小于100ug/ml的化合物10種，并有4種化合物的MIC小于50ug/ml和小于2

6、0ug/ml的化合物2種，這兩種化合物分別為S802855，MIC=18.25ug/ml；S802824化合物，MIC=6.25ug/ml。 通過測定化合物S802855和S802824化合物對細菌生長曲線影響，我們分別采用在培養(yǎng)細菌0-4周過程中，分別添加0，0.1×MIC，1×MIC和10×MIC濃度藥物，并每周采樣評價化合物對細菌的生長情況的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：這兩種化合物在0.1×MIC濃度下對細菌的抑制作用較弱，與對照

7、不加任何化合物的細菌生長相比，只抑制約0.1-0.2Log單位。在1×MIC濃度作用下，細菌對化合物較為敏感，可以抑制細菌生長1-2Log單位。在10×MIC濃度作用下，S802824化合物對細菌是完全殺死的，而且這種抑制作用是持續(xù)的；S802855化合物在細菌生長的早期(0-1周)添加時，對細菌是完全殺死的。但在細菌生長2周后添加該濃度的化合物，則不能完全殺死細菌，抑制細菌生長水平為1-1.5Log單位。 通過添加8mM濃度的

8、莽草酸，可以彌補化合物對細菌的抑制作用，而且在化合物使用濃度為0.1×MIC和1×MIC時，可以完全恢復(fù)細菌的生長，在10×MIC的濃度下，只能部分恢復(fù)細菌生長狀態(tài)。這一結(jié)果進一步從實驗中證實化合物是通過作用于莽草酸脫氫酶發(fā)揮功能的。化合物對臨床多重耐藥菌株的抑制作用測定結(jié)果表明：一種化合物對臨床耐藥菌株的MIC為11.13ug/ml，低于該化合物對敏感有毒株H37Rv的抑制。以莽草酸脫氫酶為藥物靶標(biāo)篩選新型抗結(jié)核藥的研究為開發(fā)新型抗結(jié)