HeLa和OCI-Ly3細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)蛋白核酸酶(TALEN)介導(dǎo)的microRNA-21基因敲除的研究.pdf

1、目的：⑴在HeLa人類宮頸癌細(xì)胞和OCI-Ly3人類彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（Diffuse Large B Cell Lymphoma，DLBCL）細(xì)胞中，應(yīng)用轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)蛋白核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease，TALEN)技術(shù)在基因組水平上敲除microRNA-21（miR-21）基因，分別建立miR-21敲除的穩(wěn)定細(xì)胞系，探討運用TALEN技術(shù)在不同的人類腫瘤細(xì)胞中

2、敲除microRNA基因的可行性。⑵在獲得miR-21基因敲除穩(wěn)定細(xì)胞系的基礎(chǔ)上，比較野生型（Wild type,WT）細(xì)胞和miR-21敲除(Knock out,KO)細(xì)胞在細(xì)胞及分子生物學(xué)水平上的差異，探討miR-21基因在相關(guān)腫瘤形成中的作用機(jī)制,為腫瘤診斷提供新指標(biāo)或為治療提供新靶點。
　　方法：①利用基因工程技術(shù)設(shè)計、構(gòu)建分別靶向人類miR-21基因的種子序列、莖環(huán)序列及其前體序列下游的三對TALEN表達(dá)質(zhì)粒。②分別將其

3、轉(zhuǎn)染HeLa人類宮頸癌細(xì)胞和OCI-Ly3人類彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞；通過Surveyor突變檢測法檢測TALEN誘導(dǎo)的突變效率。③PCR法篩選TALEN轉(zhuǎn)染后細(xì)胞所形成的單細(xì)胞克隆，建立在基因組水平上敲除了miR-21基因的穩(wěn)定細(xì)胞系。④使用qRT-PCR法檢測所篩選到的miR-21敲除細(xì)胞克隆中的成熟miR-21表達(dá)水平，并將雙熒光素酶miR-21報告基因載體轉(zhuǎn)入到miR-21基因敲除的HeLa細(xì)胞中，進(jìn)一步驗證miR-21基因的敲

4、除。⑤應(yīng)用MTS法繪制細(xì)胞生長曲線、單細(xì)胞平板克隆形成實驗觀察miR-21基因敲除對HeLa細(xì)胞生長、增殖的影響；軟瓊脂克隆形成實驗觀察miR-21基因缺失對HeLa細(xì)胞錨定依賴性生長的影響；使用腫瘤化療藥物順鉑處理細(xì)胞后，用MTS法和Annexin/PI雙染流式細(xì)胞檢測法觀察miR-21基因敲除的HeLa細(xì)胞對順鉑的敏感性的變化；最后還分別將野生型和miR-21基因敲除的HeLa細(xì)胞在非肥胖型糖尿病/重癥免疫缺陷/白細(xì)胞介素-2受體γ

5、鏈缺失（NSG）小鼠中進(jìn)行皮下致瘤實驗，比較它們在小鼠體內(nèi)生長的差異。⑥MicroRNA深度測序分析miR-21基因敲除對HeLa細(xì)胞中其他microRNA表達(dá)量的影響；mRNA高通量測序比較野生型HeLa細(xì)胞與miR-21基因敲除HeLa細(xì)胞間的基因譜表達(dá)差異；通過qRT-PCR和Western blot驗證miR-21相關(guān)靶基因的表達(dá)水平變化。
　　結(jié)果：⑴酶切分析和測序結(jié)果顯示：成功構(gòu)建了分別靶向人類miR-21基因種子序列

6、（TALEN Pair1，P1）、莖環(huán)序列（TALEN Pair2，P2）及其前體的下游核酸序列（TALEN Pair3，P3）的三對TALEN表達(dá)質(zhì)粒。⑵Surveyor突變檢測結(jié)果顯示我們所構(gòu)建的三對TALEN均能特異地靶向剪切人類基因組DNA，在HeLa細(xì)胞中其介導(dǎo)的突變率分別約為5.1％、7.0%和7.2%。另外，將TALEN P1和P3共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，基因組DNA突變率提高到8.4%，將TALEN P2和P3共轉(zhuǎn)染，突變率

7、提高到14.0%。⑶為了剪切HeLa細(xì)胞基因組上的miR-21序列，在LipofectamineTM2000的介導(dǎo)下我們把TALEN P1和P3同時共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，通過PCR法篩選TALEN轉(zhuǎn)染細(xì)胞后所形成的92個單細(xì)胞克隆，獲得11個帶有miR-21基因片段缺失的克隆，qRT-PCR檢測法對這些克隆進(jìn)行了細(xì)胞中成熟miR-21表達(dá)水平的檢測，結(jié)果顯示HeLa＃75的miR-21表達(dá)量僅相當(dāng)于野生型細(xì)胞的0.1%。進(jìn)而對克?。?8,

8、＃39,＃75和＃92進(jìn)行TA克隆測序，取得了其突變部位的核酸序列，從而獲知我們所使用的HeLa細(xì)胞株的miR-21基因共有三個拷貝。⑷MicroRNA深度測序及雙熒光素酶miR-21報告基因載體表達(dá)檢測均進(jìn)一步證明：HeLa＃38中miR-21表達(dá)明顯下調(diào)，而HeLa＃75中miR-21幾乎檢測不到。⑸為了獲得更多miR-21基因敲除的HeLa細(xì)胞克隆，我們對殘留一個miR-21基因表達(dá)拷貝的HeLa＃38進(jìn)行了第二輪TALEN誘導(dǎo)的

9、miR-21基因敲除。通過PCR法篩選，從164個單細(xì)胞克隆中又篩選到3個miR-21敲除的HeLa細(xì)胞克?。海?837、＃3838和＃38124。⑹MTS法繪制細(xì)胞生長曲線和單細(xì)胞平板克隆形成實驗結(jié)果顯示：和野生型相比，miR-21敲除的HeLa細(xì)胞生長速度明顯變慢。同時，軟瓊脂克隆形成實驗結(jié)果顯示：miR-21敲除的HeLa細(xì)胞的非錨定依賴性生長能力減弱，提示該細(xì)胞的侵襲性下降。⑺使用順鉑處理HeLa細(xì)胞后，MTS法繪制細(xì)胞生長曲線

10、和Annexin/PI雙染流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示：和野生型相比，miR-21基因敲除的HeLa細(xì)胞對順鉑的敏感性提高了。⑻HeLa WT和＃75、＃3837的mRNA高通量測序結(jié)果Sylamer分析顯示：＃75和＃3837中帶有miR-21靶序列的基因表達(dá)量普遍上調(diào)。⑼通過對比miR-21敲除克?。?5和＃3837與野生型HeLa細(xì)胞的mRNA高通量測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在miR-21敲除克隆中有165個基因的表達(dá)量比野生型上調(diào)了2倍以上，其中有

11、10個是TargetScan或miRecords數(shù)據(jù)庫中預(yù)測或已證明了的miR-21靶基因，我們又從中挑選了4個與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因：ACTA2、RECK、TAGLN和TGFB2進(jìn)行實時定量PCR驗證，結(jié)果顯示這4個基因的RNA水平均明顯上調(diào)，與高通量測序結(jié)果一致。⑽Western blot對公認(rèn)的miR-21靶基因PDCD4和PTEN的蛋白水平檢測顯示：在miR-21基因敲除的HeLa細(xì)胞克?。ǎ?5、＃3837、＃3838）中，PD

12、CD4和PTEN蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)。⑾HeLa細(xì)胞接種非肥胖型糖尿病/重癥免疫缺陷/白細(xì)胞介素-2受體γ鏈缺失（NSG）小鼠后的體內(nèi)致瘤實驗結(jié)果顯示：皮下致瘤3周后，WT組和miR-21表達(dá)下調(diào)的＃39組及miR-21敲除的＃75組均可以在NSG小鼠皮下形成腫瘤，雖然腫瘤的大小沒有顯著性差異，但是腫瘤病理切片HE染色顯示與WT和＃39相比較，＃75的細(xì)胞密度較低、細(xì)胞和胞核體積較小、核仁較模糊、有絲分裂期細(xì)胞比例較低，以上特點均提示m

13、iR-21敲除細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的侵襲性較低。⑿為了獲得miR-21敲除的OCI-Ly3細(xì)胞克隆進(jìn)行miR-21基因在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中功能的相關(guān)研究，我們使用Nucleofector電轉(zhuǎn)染把TALEN P1和P3以及eGFP表達(dá)質(zhì)粒同時共轉(zhuǎn)染OCI-Ly3細(xì)胞，流式分選GFP表達(dá)陽性細(xì)胞后，再通過PCR法篩選TALEN轉(zhuǎn)染后細(xì)胞所形成的984個單細(xì)胞克隆，篩選獲得4個miR-21敲除的OCI-Ly3細(xì)胞克隆：＃33、＃64、＃104和＃

14、126。
　　結(jié)論：為了研究miR-21基因在人類腫瘤細(xì)胞中的功能，我們構(gòu)建了三對靶向miR-21基因不同位點的TALEN表達(dá)質(zhì)粒，并應(yīng)用它們在HeLa和OCI-Ly3兩種人類腫瘤細(xì)胞株中成功建立了可用于體內(nèi)及體外實驗的多個miR-21敲除的細(xì)胞克隆。對miR-21敲除的HeLa細(xì)胞的分析結(jié)果顯示：不表達(dá)miR-21基因的Hela細(xì)胞生長、增殖變慢，對腫瘤化療藥物順鉑更加敏感。我們還通過高通量mRNA測序分析miR-21敲除后的H

15、eLa細(xì)胞與野生型細(xì)胞基因表達(dá)譜的差異，發(fā)現(xiàn)miR-21基因缺失顯著影響了細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞粘附、細(xì)胞外基質(zhì)形成、血管形成和血液循環(huán)等相關(guān)基因的表達(dá)。我們的實驗結(jié)果不但顯示TALEN介導(dǎo)的microRNA基因敲除技術(shù)可以被應(yīng)用于人類細(xì)胞中microRNA基因功能的研究，同時還揭示了受miR-21調(diào)控的可能與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的新通路。另外，所建立的多個miR-21基因敲除的OCI-Ly3單細(xì)胞克隆為DLBCL中miR-21基因的作用研究