脫氧膽酰酪氨酸的避孕藥效及陰道黏膜刺激研究.pdf

1、近年來，性傳播已經(jīng)成為全球艾滋病病毒(HIV)傳播的主要途徑，其中研制兼具避孕和預(yù)防AIDS/STDs的雙功能外用避孕藥特別適合我國(guó)國(guó)情。脫氧膽酰酪氨酸(deoxycholytyosine，DCT)是在保留膽酸及其衍生物可能的藥效基團(tuán)的基礎(chǔ)上，對(duì)側(cè)鏈部位用氨基酸進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾，合成了新的膽酸衍生物。本研究通過避孕藥效學(xué)、殺精機(jī)制研究、陰道粘膜刺激性研究，對(duì)于DCT的成藥性初步進(jìn)行了有效性和安全性的評(píng)價(jià)，也初步探討了DCT作為外用避孕藥的

2、殺精機(jī)制。
　　避孕藥效學(xué)研究包括體外殺精試驗(yàn)、體內(nèi)殺精試驗(yàn)與抗生育避孕試驗(yàn)。體外殺精試驗(yàn)將DCT與人類體外精子充分混合作用，觀察精子活率隨著DCT濃度及時(shí)間的變化，即劑量時(shí)間效應(yīng)試驗(yàn)，并同時(shí)得出精子的運(yùn)動(dòng)參數(shù)的變化情況。然后去除DCT作用觀察精子活力恢復(fù)情況。結(jié)果顯示DCT的殺精效果具有明顯的劑量-時(shí)間效應(yīng)，對(duì)精子運(yùn)動(dòng)活力參數(shù)和精子運(yùn)動(dòng)方式參數(shù)均有抑制作用，在去除藥物作用后精子活率沒有明顯改變（P＞0.05）。
　　體內(nèi)殺

3、精試驗(yàn)和家兔避孕試驗(yàn)選用發(fā)情期雌兔60只，隨機(jī)分成6組，陰道內(nèi)給藥，10min后與生育能力正常的雄兔1∶1進(jìn)行交配。在交配后5 min、10 min、15 min和20 min從陰道取出精液顯微鏡下觀察精子活動(dòng)情況。結(jié)果顯示DCT gel在單次陰道給予12.50 mg和25.00 mg DCT劑量時(shí)，交配后5min內(nèi)均未見活動(dòng)精子。體內(nèi)殺精試驗(yàn)約60 min后，上述各組家兔陰道給予同樣的受試物，10-15min后再與雄兔進(jìn)行1∶1交配，

4、記錄產(chǎn)仔兔情況，并計(jì)算出避孕率。結(jié)果顯示，中、高劑量組家兔達(dá)到100％的抗生育避孕效果。
　　殺精機(jī)制研究包括質(zhì)膜完整性試驗(yàn)、凋亡試驗(yàn)、頂體試驗(yàn)、線粒體試驗(yàn)以及利用掃描電鏡觀察精子結(jié)構(gòu)等。利用熒光染料SYBR-14/PI與熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀相結(jié)合定性和定量觀察DCT對(duì)精子質(zhì)膜的影響。結(jié)果顯示DCT可以明顯破壞精子質(zhì)膜，質(zhì)膜完整精子在DCT0.25、0.5和1.0 mg/ml時(shí)質(zhì)膜完整精子比率分別為（31.26±8.35）％，（

5、13.26±5.21）％和（0.74±0.93）％，與空白對(duì)照組具有明顯差別（P＜0.05），且具有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。熒光顯微鏡結(jié)合FITC-PSA/PI雙染觀察精子頂體影響，結(jié)果顯示，DCT處理后精子頂體區(qū)染色暗淡切不均勻，或者根本沒有熒光染色，可見DCT對(duì)于精子頂體具有明顯的破壞作用。利用熒光染料JC-1與熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀相結(jié)合定性和定量觀察DCT對(duì)精子線粒體膜電位的影響。結(jié)果顯示，DCT處理后精子線粒體膜電位發(fā)生改變，精子

6、尾部綠色熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。FCM結(jié)果顯示精子線粒體膜電位隨著DCT濃度的升高而逐漸下降，正常線粒體膜電位精子比例與空白對(duì)照組有明顯的差別(P＜0.05)。凋亡精子檢測(cè)顯示晚期凋亡精子比率在0.25，0.5和1.0mg/ml時(shí)，分別是（11.92±1.19）％、（30.09±6.29）％和（75.55±6.30）％，具有明顯的劑量依賴性（P＜0.05）。DCT≤0.5 g·L-1引起精子早期凋亡率升高，但是高濃度時(shí)卻出現(xiàn)降低趨勢(shì)。電鏡結(jié)果

7、顯示DCT處理后大部分精子的頂體脫失，質(zhì)膜不完整，被溶解、破壞;尾部出現(xiàn)穿孔甚至斷裂。
　　陰道黏膜刺激性試驗(yàn)選用成年雌性小型豬9只，隨機(jī)分為3組，分別為基質(zhì)對(duì)照組、N-9 jelly組和DCT-gel組。在休情期每天單次陰道給藥5ml不同受試物，連續(xù)7天，給藥前和末次給藥后24h、72h收集陰道灌流液，取沉淀細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測(cè)炎癥細(xì)胞及CD45+細(xì)胞比例。末次給藥后72h處死動(dòng)物，切開陰道進(jìn)行肉眼觀察，然后分離出陰道組織，分別

8、用10％福爾馬林液固定、包埋、切片，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。然后利用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)陰道黏膜CD45表達(dá)。結(jié)果顯示，市售N-9 jelly能引起陰道粘膜組織的炎癥反應(yīng)，而導(dǎo)致CVL液中的細(xì)胞總數(shù)特別是中性粒細(xì)胞及CD45+細(xì)胞增多，DCT gel組和基質(zhì)對(duì)照組與N-9jelly明顯不同，它們沒有引起小型豬CVL液中性粒細(xì)胞和CD45+細(xì)胞數(shù)量上明顯的增加。
　　從組織學(xué)變化角度，小型豬陰道黏膜組織HE染色顯示DCT gel對(duì)黏膜上