真性紅細(xì)胞增多癥JAK2基因突變的檢測及其臨床意義.pdf

1、目的：應(yīng)用等位基因特異性PCR技術(shù)和基因測序技術(shù)研究真性紅細(xì)胞增多癥（PV）中JAK2 V617F基因突變的發(fā)生率及其臨床意義。 方法：①研究對象：將112例惡性血液疾病患者分為三組。20例PV患者為PV組，其中男13例、女7例，年齡36—66歲。20例原發(fā)性血小板增多癥（ET）、6例特發(fā)性骨髓纖維化（IMF）共26例作為其他MPD組進(jìn)行檢測。66例其他惡性血液疾病列為對照組，包括31例急性髓系白血病（AML）、13例急性淋巴細(xì)

2、胞白血?。ˋLL）、17例慢性粒細(xì)胞白血?。–ML）、和5例慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL）。另將5名健康正常人作為正常對照。PV的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照PVSG和WHO制定的標(biāo)準(zhǔn)。②基因組DNA的制備：抽取患者外周血5 ml，常規(guī)分離白細(xì)胞，用QIAamp DNA mini kit按說明提取白細(xì)胞基因組DNA?；蚪MDNA的終濃度為100—200μg/ml。③PCR引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增：根據(jù)JAK2 V617F突變所在的第12外顯子共設(shè)計(jì)三條引物，

3、即上游的外側(cè)引物和特異引物兩條、下游的一條通用引物。外側(cè)引物擴(kuò)增片斷為364bp，作為內(nèi)對照，其引物為5’—ATCTATAGTCATGCTGAAAGAGGAGAAAG—3’；特異引物擴(kuò)增片斷長度203 bp，該引物跨越JAK2 V617F（G→T）的突變位點(diǎn)，其3’端的倒數(shù)第三位堿基錯配設(shè)計(jì)，以擴(kuò)增具有JAK2 V617F突變的標(biāo)本，該特異引物為5’—AGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATT—3’；下游的通用引物為5

4、’—CTGAATAGTCCTACAGTGTTTTCAGTTTCA—3’。反應(yīng)體系為10×緩沖液2．5μl，引物（20μmol/L）1．6μl（包括外側(cè)引物和特異引物、下游通用引物），10mmol/L dNTPs0．5μl，25mmol/L MgCl21．4μl，Taq DNA聚合酶0．25μl，DNA模板25 ng，加去離子水至終體積25μl。反應(yīng)程序?yàn)椋簯?yīng)用Touch—Down程序，94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30s，65—56

5、℃退火40s，72℃延伸30s，10個循環(huán)；94℃變性30s，58℃退火40s，72℃延伸30s，33個循環(huán)；最后720C延伸7 min。④瓊脂糖凝膠電泳：產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳后紫外光透視儀分析圖像并照相。⑤基因測序：對陽性標(biāo)本和隨機(jī)抽取的10例陰性標(biāo)本，再次分別在與上述相同的反應(yīng)體系和程序條件下，以外側(cè)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過純化后，由上海生工生物公司進(jìn)行測序。將所得到的測序結(jié)果與野生型基因序列進(jìn)行對比。⑥統(tǒng)

6、計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS（10．0）統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果：①JAK2 V617F突變檢測情況：等位基因特異性PCR檢測發(fā)現(xiàn)JAK2 V617F突變陽性標(biāo)本有203bp和364bp兩條條帶，而陰性標(biāo)本只有一條364bp條帶。20例PV中有14例存在JAK2 V617F突變（70．0%）；40%的ET和33．3%IMF患者JAK2 V617F呈陽性。而AML、ALL、CML和CLL患者均未檢測到JAK2 V617F突變現(xiàn)象

7、。5例正常人也為陰性。PV組與對照組比較，P<0．001，而PV組與其他BCR/ABL陰性MPD組比較，P<0．05。②基因測序：等位基因特異性PCR檢測所發(fā)現(xiàn)的陽性標(biāo)本和所有的陰性標(biāo)本進(jìn)行基因測序?；驕y序結(jié)果與等位基因特異性PCR檢測相一致。③JAK2 V617F突變陽性與陰性PV的臨床特征：將20例PV病例根據(jù)JAK2 V617F突變發(fā)生情況進(jìn)一步分為JAK2 V617F陽性PV和JAK2 V617F陰性PV兩個亞組。JAK2 V

8、617F陽性組男10例、女4例，年齡36—66歲（平均57．6歲），Hb為179．0g/L—217．0 g/L（平均191．4g/L），WBC為5．9×109/L—22．6×109/L（平均13．2×109/L），BPC為153．0×109/L—787．0×109/L（平均297．5×109/L），Hct為51．0%—67．0%（平均59．1%）。JAK2 V617F陰性組男3例、女3例，年齡42—70歲（平均55．8歲），Hb為185

9、．0g/L—225．0g/L（平均199．3 g/L），WBC為8．0×109/L—14．9×109／L（平均10．3×109/L），BPC為163．0×109/L—246．0×109/L（平均209．7×109/L），Hct為56．0%—70．0%（平均61．7%）。JAK2 V617F陽性PV組脾腫大4例和肝腫大1例、陰性組脾腫大3例、無肝腫大病例，兩組所有病例骨髓檢查都是三系增生活躍。JAK2 V617F陽性和陰性病人的年齡、性別

10、、外周血象、骨髓檢查和肝脾腫大等臨床生物學(xué)檢查結(jié)果均無顯著差異（兩組比較均為P>0．05）。④JAK2 V617F陽性ET患者的Hb和WBC明顯高于陰性患者，羥基脲的治療效果較好，臨床特征與PV患者相似；而JAK2 V617F陰性ET患者則以單純BPC升高為主。 結(jié)論：PV患者中JAK2 V617F突變高達(dá)70%（14/20例），高于其他MPD（ET和IMF）中的陽性率；而在AML、ALL、CLL、MDS等疾病中均陰性。因此，J