重組腺病毒介導(dǎo)人野生型p53、GM-CSF和B7-1基因?qū)盒阅[瘤生物治療的臨床前研究.pdf

1、惡性腫瘤因其高發(fā)病率、高死亡率近年來(lái)一直是嚴(yán)重危害人類健康的重要疾病之一。目前臨床上常用的治療方法(手術(shù)、化療和放療)都存在一定的局限性，因此需要探索新的更加有效的治療方法。本室構(gòu)建的攜帶人野生型p53基因和腫瘤免疫相關(guān)基因GM-CSF、B7-1的重組腺病毒(命名為重組腺病毒BB-102抗癌劑)，感染喉癌、肝癌、肺癌、乳腺癌和慢性髓性白血病原代細(xì)胞后，能明顯抑制癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，而且體外能誘導(dǎo)自體外周血淋巴細(xì)胞生成腫瘤殺傷性的C

2、TL。本實(shí)驗(yàn)對(duì)該重組腺病毒進(jìn)行了臨床前研究，完成了以下工作： 1.重組腺病毒的制備、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量控制協(xié)助中國(guó)藥品生物制品質(zhì)量檢定所擬訂了《重組腺病毒BB-102制造和檢定規(guī)程》。在293細(xì)胞中分別擴(kuò)增BB-102以及攜帶綠色熒光蛋白基因的對(duì)照重組腺病毒Ad-GFP；以氯化銫密度梯度超速離心法純化病毒；以蝕斑分析法測(cè)定病毒滴度；按照《中國(guó)生物制品規(guī)程》之通則和《重組腺病毒BB-102制造和檢定規(guī)程》，檢測(cè)重組腺病毒BB-102的

3、質(zhì)量。結(jié)果表明：Ad-GFP和BB-102的滴度分別為1.1×1011和5×1010；重組腺病毒BB-102的質(zhì)量符合以上兩個(gè)規(guī)程的要求。 2.重組腺病毒BB-102抗癌劑穩(wěn)定性研究探討不同溫度和不同保護(hù)劑對(duì)重組腺病毒載體穩(wěn)定性的影響。以含10％甘油的Hank's液保存BB-102和Ad-GFP，以快速細(xì)胞病變法、ELISA法、流式細(xì)胞儀、電鏡觀察分別檢測(cè)在不同溫度不同保存期重組腺病毒載體的滴度、轉(zhuǎn)染率、目的基因表達(dá)的變化。結(jié)果

4、顯示-60℃保存55個(gè)月、-20℃保存44個(gè)月時(shí)各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)明顯變化；4℃保存不宜超過(guò)3個(gè)月；不宜室溫保存。結(jié)論：本制劑保存于-20℃以下性能穩(wěn)定，可滿足臨床儲(chǔ)存和應(yīng)用。 以不同濃度的甘油、明膠、蔗糖、乳糖、葡萄糖、麥芽糖、山梨醇、甘露醇為保護(hù)劑，室溫保存Ad-GFP，保存期分別為1～4天、1～4周、1～3月。檢測(cè)其滴度、轉(zhuǎn)染率和目的基因表達(dá)。結(jié)果顯示：濃度小于1％的明膠具有較好的保護(hù)作用，3個(gè)月時(shí)病毒仍有較高的轉(zhuǎn)染率。乳糖、蔗糖

5、和甘露醇也可作為室溫保存時(shí)的備選保護(hù)劑，但保存期限不宜超過(guò)1個(gè)月。 3.重組腺病毒BB-102抗癌劑生物體內(nèi)有效性研究探討重組腺病毒介導(dǎo)的p53、B7-1和GM-CSF基因(BB-102)對(duì)荷瘤裸鼠體內(nèi)人喉癌細(xì)胞的基因治療效果，為喉癌基因治療臨床研究提供依據(jù)。建立喉癌裸鼠模型，瘤內(nèi)注射BB-102、Ad-GFP和PBS，對(duì)腫瘤組織進(jìn)行測(cè)量、病理學(xué)檢查、免疫組化等研究。在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間經(jīng)多因素析因方差分析，腫瘤重量和瘤體積具有

6、顯著性差異。經(jīng)治療后，實(shí)驗(yàn)組腫瘤中未發(fā)現(xiàn)突變型p53的表達(dá)，Ki67陽(yáng)性表達(dá)率極低，光鏡和透射電鏡下可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。BB-102在喉癌細(xì)胞中有效表達(dá)，抑制其生長(zhǎng)，誘導(dǎo)其凋亡；5×108pfu是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的最佳起始有效劑量。 4.重組腺病毒BB-102抗癌劑的安全性評(píng)價(jià)BB-102急性毒性試驗(yàn)表明：小鼠肌肉和腹腔注射BB-102，未見(jiàn)明顯的毒性反應(yīng)。小鼠一次肌肉注射BB-102，雌性小鼠MTD大于4.84×1011pfu/kg，

7、雄性小鼠MTD大于4.67×1011pfu/kg；小鼠一次腹腔注射BB-102，雌性小鼠MTD大于4.87×1011pfu/kg，雄性小鼠MTD大于4.74×1011pfu/kg。 BB-102慢毒性試驗(yàn)結(jié)果表明：獼猴連續(xù)15次皮下注射5.0x10810pfu/kg腺病毒BB-102抗癌劑后未見(jiàn)任何不良反應(yīng)。連續(xù)皮下注射15次5.0x109和5.0x1010pfu/kg的BB-102后，除了與效應(yīng)有關(guān)的白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、血小

8、板計(jì)數(shù)(PLT)、網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)藥后有劑量依賴性升高外，其余各項(xiàng)觀測(cè)指標(biāo)未見(jiàn)明顯變化。故可認(rèn)為5.0x108pfu/kg以下為安全劑量。 給藥8次后血清中出現(xiàn)抗Adv的中和抗體，停藥30周后中和抗體消失。 除注射部皮膚、肌肉、肝臟和肺臟有重組腺病毒載體分布外，其他組織器官未檢測(cè)到其分布。 一般藥理試驗(yàn)結(jié)果表明：重組腺病毒BB-102抗癌劑對(duì)動(dòng)物的一般行為狀態(tài)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、腸蠕動(dòng)無(wú)明顯的影響。