雞核因子-κB受體激活物配基(chRANKL)基因的克隆、表達(dá)及生物學(xué)活性研究.pdf

1、核因子-кB受體激活物配基RANKL(receptor activator of NF-кB ligand，RANKL)最早發(fā)現(xiàn)于哺乳動(dòng)物，屬于腫瘤壞死因子(TNF)超家族的一員，它參與破骨細(xì)胞形成的全過(guò)程：分化、融合、生存、激活，被認(rèn)為是介導(dǎo)各種刺激因子誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成及功能信號(hào)傳導(dǎo)的最終因子。鑒于RANKL在骨代謝中的重要調(diào)節(jié)作用，本文旨在克隆表達(dá)蛋雞RANKL蛋白，并對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行研究，為進(jìn)一步研究籠養(yǎng)蛋雞骨質(zhì)疏松發(fā)生機(jī)制提供

2、新的思路。 試驗(yàn)I、chRANKL編碼區(qū)基因的克隆與序列分析 應(yīng)用RT-PCR方法從體外培養(yǎng)雞胚成骨細(xì)胞中擴(kuò)增得到雞RANKL編碼基因(Genbank登錄號(hào)EF379383)，然后將特異性片段連接到pMD18-T載體，經(jīng)酶切、PCR鑒定及DNA序列測(cè)定。結(jié)果表明，擴(kuò)增得到1203 bp的RANKL序列，擴(kuò)增序列與GenBank上報(bào)道的預(yù)測(cè)序列具有很高的相似性，達(dá)到99.3％，與人、小鼠、犬的一致性分別為55.4％、52％

3、和55.7％，進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明RANKL作為機(jī)體內(nèi)調(diào)節(jié)骨代謝一種重要細(xì)胞因子，在進(jìn)化中高度保守。RANKL基因的成功擴(kuò)增為深入研究骨質(zhì)疏松等代謝性骨病的發(fā)病機(jī)制及防治開(kāi)辟?gòu)V闊的領(lǐng)域。 試驗(yàn)II、chRANKL的原核表達(dá)和純化 設(shè)計(jì)一對(duì)引物用于克隆雞RANKL成熟蛋白編碼基因，然后構(gòu)建雞RANKL原核表達(dá)載體pET-32a(+)-chRANKL，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組雞RANKL成熟蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，原

4、核表達(dá)產(chǎn)物為64 kD的重組蛋白，并主要以包涵體形式存在，western blot分析結(jié)果顯示，表達(dá)得到的重組蛋白具有良好的抗原結(jié)合活性。 試驗(yàn)III、chRANKL誘導(dǎo)雞骨髓細(xì)胞形成破骨樣細(xì)胞的研究 建立簡(jiǎn)便有效的雞胚骨髓破骨樣細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)體系，獲得高密度高純度的破骨細(xì)胞，為進(jìn)一步研究籠養(yǎng)蛋雞骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。剔取18日齡雞胚脛骨和肱骨，用注射器抽取a-MEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，獲取的細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)板。

5、2h后吸取未貼壁細(xì)胞，離心重懸，使細(xì)胞密度為2×106/mL，接種于培養(yǎng)板，加入誘導(dǎo)劑RANKL和M-CSF，成功獲得具有破骨細(xì)胞特征的細(xì)胞：細(xì)胞大，多核；TRAP染色陽(yáng)性，在骨片表面形成吸收陷窩；這表明chRANKL能誘導(dǎo)雞破骨細(xì)胞前體細(xì)胞形成OLC，說(shuō)明chRANKL在雞OC分化、成熟過(guò)程中起重要作用。但加入chOPG后，則大大降低了OLC的形成以及OLC的骨吸收作用，表明chOPG阻斷了RANKL介導(dǎo)的OC分化和骨吸收作用。

6、 試驗(yàn)IV、chRANKL在畢赤酵母中的表達(dá)和生物學(xué)活性研究 設(shè)計(jì)另一對(duì)引物用于克隆雞RANKL成熟蛋白編碼基因，然后構(gòu)建雞RANKL真核表達(dá)載體pPICZa-A-chRANKL，以電穿孔法轉(zhuǎn)化酵母X-33，用Zeocin平板篩選重組子，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS-PAGE和免疫印跡分析表達(dá)產(chǎn)物，表達(dá)產(chǎn)物相對(duì)分子量為54 kDa，表達(dá)量約為220 mg/L，經(jīng)Western印跡驗(yàn)證，表達(dá)得到的蛋白能夠與抗人RANKL IgG反應(yīng)

7、，表明通過(guò)酵母表達(dá)得到的蛋白具有較好的免疫原性。 試驗(yàn)V、chRANKL酵母凍干產(chǎn)物體內(nèi)、體外對(duì)成熟破骨細(xì)胞的影響 50羽青年ISA蛋雞分為5組，A組為對(duì)照組，只注射生理鹽水，B、C、D、E組分別注射劑量為0.01 mg/kg，0.05 mg/kg，0.1 mg/kg，0.5 mg/kg的RANKL酵母表達(dá)凍干產(chǎn)物水溶物。2h后靜脈采血，測(cè)定血漿鈣離子濃度。同時(shí)將濃度為2 ng/mL，6ng/mL，10 ng/mL分別加