17β-雌二醇對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖及P21ras和P-ERK表達(dá)的影響.pdf

1、背景及目的:子宮內(nèi)膜癌為危害女性健康的女性生殖道常見(jiàn)三大惡性腫瘤之一,近年來(lái)發(fā)病率有明顯上升趨勢(shì)。在歐美等某些發(fā)達(dá)國(guó)家,其發(fā)病率已高居女性生殖道惡性腫瘤之首?！盁o(wú)孕激素對(duì)抗的雌激素的長(zhǎng)期刺激”是子宮內(nèi)膜癌發(fā)病的常見(jiàn)原因之一,但雌激素致子宮內(nèi)膜癌的具體作用機(jī)制目前尚不清楚。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為,雌激素與其受體結(jié)合后在細(xì)胞核通過(guò)“基因組轉(zhuǎn)錄效應(yīng)”來(lái)發(fā)揮作用,該過(guò)程往往需要數(shù)小時(shí)才會(huì)增加蛋白的合成,故又稱為長(zhǎng)期效應(yīng)。最近的研究發(fā)現(xiàn),雌激素還具有生長(zhǎng)

2、因子樣的“非基因組轉(zhuǎn)錄效應(yīng)”,與膜受體結(jié)合后可以快速引發(fā)一系列的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。這些快速效應(yīng)通常數(shù)分鐘或數(shù)十分鐘便可產(chǎn)生,無(wú)法用經(jīng)典的基因組轉(zhuǎn)錄學(xué)說(shuō)來(lái)解釋,我們稱之為雌激素的快速效應(yīng),或非基因組轉(zhuǎn)錄效應(yīng)。研究已經(jīng)證實(shí),雌激素可激活子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,從而促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。雌激素是否可激活子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路,從而促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖,國(guó)內(nèi)鮮見(jiàn)報(bào)道。P2

3、1ras蛋白是由原癌基因ras編碼的分子量為21KD的膜結(jié)合型表達(dá)蛋白,也是MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的主要成員。P-ERK是細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)的活性形式,ERK是MAPK家族中的一類脯氨酸導(dǎo)向的絲/蘇氨酸蛋白激酶,正常定位于胞漿,激活后形成P-ERK,轉(zhuǎn)位至胞核,產(chǎn)生細(xì)胞效應(yīng)。其可磷酸化轉(zhuǎn)錄因子,啟動(dòng)一些即早基因的表達(dá)如c-jun和c-fos等,誘導(dǎo)cy

4、clinD1和c-myc等癌基因表達(dá),cyclin D1的表達(dá)促使細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)化,最終導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖。此外,P-ERK還可以上調(diào)cyclinE的表達(dá),并滅活細(xì)胞周期抑制蛋白P27KIP,從多個(gè)水平調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。因此,本課題以雌激素受體陽(yáng)性的Ishikawa和雌激素受體低表達(dá)的HEC-1A細(xì)胞為研究對(duì)象,研究了雌激素對(duì)P21ras和P-ERK的活化及對(duì)細(xì)胞增殖、周期的影響,初步探討了雌激素通過(guò)“非基因組轉(zhuǎn)錄效

5、應(yīng)”對(duì)MAPK通路活化,從而為子宮內(nèi)膜癌的治療提供理論依據(jù)。
　　材料與方法:
　　1、材料:人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系Ishikawa來(lái)源于人子宮內(nèi)膜高分化腺癌,雌激素受體(ER)陽(yáng)性,HEC-1A來(lái)源于美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù),ER低表達(dá),均由北京大學(xué)人民醫(yī)院婦科實(shí)驗(yàn)室魏麗惠教授惠贈(zèng)。細(xì)胞置于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),均貼壁生長(zhǎng),根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)每1~3天換液或傳代。
　　2、方法:(

6、1)運(yùn)用MTT法檢測(cè)不同濃度的E2(空白對(duì)照,10-10mol/L、10-8mol/L、10-6mol/L和10-4mol/L)作用于Ishikawa和HEC-1A細(xì)胞不同時(shí)間(24h,48h,72h)后細(xì)胞的吸光度值的變化。
　　(2)應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)不同濃度的E2(空白對(duì)照,10-8mol/L和10-6mol/L)作用于Ishikawa和HEC-1A細(xì)胞相同時(shí)間24h后細(xì)胞的增殖周期的改變。
　　(3)應(yīng)用免疫細(xì)胞化

7、學(xué)檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中P21ras和P-ERK的活性,觀察濃度為10-6mol/L的E2分別作用于2種細(xì)胞不同時(shí)間(空白對(duì)照,5min,15min,30min,1h,2h)后,得出最佳活化時(shí)間;不同濃度的E2(空白對(duì)照,10-10mol/L、10-8mol/L、10-6mol/L和10-4mol/L)分別作用于2種細(xì)胞的最佳時(shí)間,分析P21ras和P-ERK的時(shí)間效應(yīng),濃度效應(yīng),兩者之間的相關(guān)性及與ER的關(guān)系。
　　3、采用SPS

8、S13.0軟件統(tǒng)計(jì),細(xì)胞吸光度值和細(xì)胞周期的結(jié)果用單因素方差分析,P21ras和P-ERK比較用t或t’檢驗(yàn),P21ras和P-ERK與ER的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析,以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:1、隨著E2濃度增加,Ishikawa細(xì)胞的增殖活性呈時(shí)間依賴性(F≥32.93,P≤0.001),細(xì)胞周期中G0-G1期比例下降(F=54.552,P≤0.001),S期比例升高(F=40.88,P=0.000)

9、;HEC-1A細(xì)胞的增殖活性及細(xì)胞周期各期比例變化不顯著(p均＞0.05)。
　　2、檢測(cè)P21ras和P-ERK的活化水平中,10-6mol/L的E2作用于Ishikawa細(xì)胞30min時(shí)P21ras和P-ERK的活化最顯著(74.00±2.5495,68.00±4.8166),作用于HEC-1A細(xì)胞15min時(shí),P21ras和P-ERK即有明顯激活而且達(dá)到高峰(78.00±3.1623,74.00±2.3022)。隨著E2濃度

10、增加2種細(xì)胞中P21ras和P-ERK表達(dá)均逐漸增加,呈濃度依賴性的特點(diǎn)。
　　3、不同時(shí)間,不同濃度E2作用下,2種子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中P21ras和P-ERK之間均呈正相關(guān)(r≥0.049,p≤0.027,r≥0.047,p≤0.036),P21ras,P-ERK兩種蛋白在ER(+)的Ishikawa和ER低表達(dá)的HEC-1A細(xì)胞中的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)(r≤-0.049,p≤0.030,r≤-0.048,p≤0.032)。
　　

11、結(jié)論:1.E2可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa(ER+)細(xì)胞增殖和周期的進(jìn)展,而對(duì)ER低表達(dá)的HEC-1A細(xì)胞增殖作用不顯著,可能是由與兩種細(xì)胞內(nèi)ER水平不同,在ER(+)的Ishikawa細(xì)胞,E2可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄和非轉(zhuǎn)錄兩種機(jī)制來(lái)影響細(xì)胞的增殖狀態(tài)和周期進(jìn)展,而在HEC-1A細(xì)胞,E2僅能通過(guò)非轉(zhuǎn)錄效應(yīng)一種機(jī)制來(lái)產(chǎn)生效應(yīng)。
　　2.E2可以迅速促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中P21ras和P-ERK的活化,并呈濃度依賴性且兩種蛋白表達(dá)之間呈