抗β-,1-腎上腺素受體細(xì)胞外第二環(huán)自身抗體導(dǎo)致大鼠多臟器損傷及其相關(guān)機(jī)制.pdf

1、研究背景和目的：β腎上腺素受體(β—adrenoceptor，β—AR)是交感神經(jīng)系統(tǒng)的重要成員，通過(guò)介導(dǎo)體內(nèi)兒茶酚胺類(lèi)物質(zhì)的生理效應(yīng)，在調(diào)節(jié)心臟活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。β—AR屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，目前已確認(rèn)的β1、β2和β3AR三個(gè)亞型具有相同的結(jié)構(gòu)特征，即含有由7個(gè)22～28個(gè)疏水性氨基酸殘基組成的跨膜區(qū)，連接這些跨膜區(qū)的親水性氨基酸片段構(gòu)成了3個(gè)細(xì)胞內(nèi)環(huán)和3個(gè)細(xì)胞外環(huán)。在這三種β—AR亞型中，β1AR在心臟的分布密度最高。當(dāng)該受

2、體受神經(jīng)、體液因素調(diào)節(jié)激活時(shí)，通過(guò)興奮型G蛋白—腺苷酸環(huán)化酶—環(huán)磷酸腺苷系統(tǒng)，使心臟產(chǎn)生正性變時(shí)、正性變力、正性變傳導(dǎo)效應(yīng)，以適應(yīng)機(jī)體對(duì)血液供應(yīng)的需求。 Ⅰ．抗β1-AR-ECⅡ抗體可導(dǎo)致心肌重構(gòu)及可能的機(jī)制。 第一分題：抗β1-AR-ECⅡ抗體可導(dǎo)致心肌結(jié)構(gòu)重構(gòu)及可能的機(jī)制。 目的： 1．觀察抗β1-AR-ECⅡ抗體被動(dòng)免疫過(guò)程中，大鼠心肌形態(tài)學(xué)及心功能的變化情況； 2．觀察被動(dòng)免疫過(guò)程中，細(xì)胞

3、內(nèi)游離鈣水平及CaMKⅡδ的表達(dá)情況。 方法： (1)分別選取健康成年雄性Wistar大鼠(n=60，體重180～220g)，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，用ELISA法篩選血清抗β1AR-ECⅡ抗體陰性的動(dòng)物進(jìn)行分組。 (2)肽段合成：抗原肽段由吉爾生化上海有限公司合成，相當(dāng)于人β1-AR細(xì)胞外第二環(huán)氨基酸序列的特異性抗原決定簇(197-223位，HWW RAESDEARRCYNDPKCCDFVT NRA)，

4、合成肽段純度為95％(見(jiàn)表1)。合成的肽段儲(chǔ)存于-20℃?zhèn)溆谩?(3)通過(guò)大鼠尾靜脈定期給入抗體建立被動(dòng)免疫模型，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)檢測(cè)免疫過(guò)程中大鼠血清中抗β1—AR—ECⅡ抗體水平的變化； (4)分別用體視學(xué)指標(biāo)、Masson三色染色及心重體重比的測(cè)量來(lái)反映被動(dòng)免疫過(guò)程中大鼠心臟結(jié)構(gòu)的變化； (5)經(jīng)右側(cè)頸總動(dòng)脈插管進(jìn)入左心室，監(jiān)測(cè)心率(Heartrates，HR)、左心室收縮壓(Left ve

5、ntricular systolic pressure，LVSP)、左心室舒張壓(Left ventricular diastolic pressure，LVDP)和左心室壓力變化最大速率(±dp/dtmax)等心功能指標(biāo)； (6)分別采用原位末端標(biāo)記法(TUNEL)和Caspase-3、8、9活性測(cè)定法檢測(cè)大鼠心肌組織中心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生情況； (7)用Fluo-3—AM探針標(biāo)記，激光共聚焦測(cè)定被動(dòng)免疫末期大鼠單個(gè)心室肌

6、細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子的水平； (8)用Western—blot及免疫組化法檢測(cè)大鼠心肌組織中CaMKⅡδ蛋白的表達(dá)水平。 第二分題：抗β1—AR—ECⅡ抗體導(dǎo)致心電重構(gòu)及其可能的機(jī)制。 目的： 1．觀察抗β1—AR—ECⅡ抗體是否具有直接致心律失常的作用； 2．在組織和細(xì)胞水平，探討抗β1—AR—ECⅡ抗體致心律失常的可能機(jī)制，以求闡明抗β1—AR—ECⅡ抗體是否可致心電重構(gòu)及其可能的機(jī)制，為臨床抗β

7、1—AR—ECⅡ抗體陽(yáng)性心律失?；颊叩闹委熖峁├碚撘罁?jù)。 方法： (1)分別選取健康成年雄性Wistar大鼠(n=172)(其中因麻醉死亡5只，不明原因死亡5只)，體重180～220g，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，用ELISA法篩選血清抗β1—AR—ECⅡ抗體陰性的動(dòng)物進(jìn)行分組。 (2)通過(guò)在體心功能及心電測(cè)定方法監(jiān)測(cè)給入抗β1—AR—ECⅡ抗體后正常大鼠心功能及心電圖的變化情況； (3)通過(guò)微電極記

8、錄動(dòng)作電位的方法，觀察在組織水平抗β1—AR—ECⅡ抗體對(duì)乳頭肌動(dòng)作電位的影響，同時(shí)分析動(dòng)作電位時(shí)程(APD)的變化情況； (4)通過(guò)建立主動(dòng)及被動(dòng)免疫模型，觀察抗β1—AR—ECⅡ抗體長(zhǎng)期存在對(duì)大鼠心電活動(dòng)的影響，同時(shí)分析QT間期的變化； (5)通過(guò)膜片鉗技術(shù)及胞內(nèi)鈣熒光測(cè)定技術(shù)，觀察抗β1—AR—ECⅡ抗體長(zhǎng)期存在對(duì)大鼠心肌細(xì)胞膜電流及胞內(nèi)鈣的影響。 結(jié)論： 1．抗β1—AR—ECⅡ抗體長(zhǎng)期存在可導(dǎo)致

9、大鼠心肌重構(gòu)及心功能障礙的發(fā)生，這可能與心肌細(xì)胞中游離鈣離子水平升高導(dǎo)致CaMKⅡδ的表達(dá)增加，進(jìn)而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡增加有關(guān)。 2．抗β1—AR—ECⅡ抗體可導(dǎo)致心律失常的發(fā)生，其機(jī)制可能與細(xì)胞膜靜息電位減小，Ik1、Ito及ⅠNa—Ca電流的減弱和ⅠCa—L電流的增強(qiáng)導(dǎo)致的胞內(nèi)鈣離子水平升高和動(dòng)作電位時(shí)程延長(zhǎng)有關(guān)。 Ⅱ．抗β1—AR—ECⅡ抗體長(zhǎng)期存在可導(dǎo)致大鼠肝臟損傷。 目的:證實(shí)抗β1—AR—ECⅡ抗體長(zhǎng)期

10、存在是否會(huì)對(duì)大鼠肝臟的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響。 方法: (1)建立主動(dòng)及被動(dòng)免疫模型，用ELISA法檢測(cè)大鼠血清中抗β1—AR—ECⅡ抗體水平的變化； (2)用HE和Masson三色染色，觀察抗β1—AR—ECⅡ抗體長(zhǎng)期存在對(duì)肝臟結(jié)構(gòu)的影響； (3)通過(guò)檢測(cè)反映肝功能的血清學(xué)指標(biāo)，來(lái)證實(shí)抗β1—AR—ECⅡ抗體長(zhǎng)期存在對(duì)肝功能的影響。 結(jié)論：抗β1—AR—ECⅡ抗體長(zhǎng)期存在可導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)和功能的損傷，

11、因此，血清中存在高水平抗β1—AR—ECⅡ抗體時(shí)，應(yīng)密切關(guān)注患者肝功能的變化。 Ⅲ．抗β1—AR—ECⅡ抗體長(zhǎng)期存在可導(dǎo)致大鼠腎臟損傷。 目的：觀察抗β1—AR—ECⅡ抗體長(zhǎng)期存在能否導(dǎo)致大鼠腎臟結(jié)構(gòu)和功能的損傷。 方法： (1)建立主動(dòng)及被動(dòng)免疫模型，用ELISA法檢測(cè)大鼠血清中抗β1—AR—ECⅡ抗體水平的變化； (2)用HE和Masson三色染色，觀察抗β1—AR—ECⅡ抗體長(zhǎng)期存在對(duì)腎臟結(jié)

12、構(gòu)的影響； (3)通過(guò)檢測(cè)反映腎功能的血清學(xué)指標(biāo)，來(lái)證實(shí)抗β1—AR—ECⅡ抗體長(zhǎng)期存在對(duì)腎功能的影響。 結(jié)論：抗β1—AR—ECⅡ抗體長(zhǎng)期存在會(huì)對(duì)腎臟結(jié)構(gòu)及功能產(chǎn)生一定損傷，因此，血清中存在高水平抗β1—AR—ECⅡ抗體的患者應(yīng)密切關(guān)注腎功能的變化情況。 本研究中存在一些不足之處：關(guān)于抗β1—AR—ECⅡ抗體致心肌細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路研究中，只觀察到：在主動(dòng)及被動(dòng)免疫過(guò)程中，隨著免疫時(shí)間的延長(zhǎng)心肌CaMKⅡδ的表

13、達(dá)逐漸增加，但尚缺乏抗β1—AR—ECⅡ抗體直接作用能否導(dǎo)致CaMKⅡδ的表達(dá)增加，以及抑制CaMKⅡδ后，抗β1—AR—ECⅡ抗體誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡是否會(huì)減少等一系列問(wèn)題，對(duì)于這些問(wèn)題的解釋?zhuān)瑢⑼ㄟ^(guò)進(jìn)一步的成鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)證實(shí)。 本研究首次發(fā)現(xiàn)抗β1—AR—ECⅡ抗體可致肝腎損傷，但其如何導(dǎo)致肝腎損傷及其相關(guān)機(jī)制還有待進(jìn)一步深入。 結(jié)論： 1．抗β1—AR—ECⅡ抗體長(zhǎng)期存在可導(dǎo)致大鼠心肌重構(gòu)及心功能障礙的發(fā)

14、生，這可能與心肌細(xì)胞中游離鈣離子水平升高導(dǎo)致CaMKⅡδ的表達(dá)增加，進(jìn)而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡增加有關(guān)。 2．抗β1—AR—ECⅡ抗體可導(dǎo)致心律失常的發(fā)生，其機(jī)制可能與細(xì)胞膜靜息電位減小，Ik1、Ito及INa—Ca電流的減弱和ICa—L電流的增強(qiáng)導(dǎo)致的胞內(nèi)鈣離子水平升高和動(dòng)作電位時(shí)程延長(zhǎng)有關(guān)。 3．抗β1—AR—ECⅡ抗體長(zhǎng)期存在可導(dǎo)致一定程度的肝腎損傷。環(huán)中產(chǎn)生的抗β1-AR-ECⅡ抗體是否也能通過(guò)與肝臟和腎臟細(xì)胞表面的β

15、1-AR結(jié)合，從而產(chǎn)生一定的作用呢? 前期在用β1—AR—ECⅡ肽段進(jìn)行18個(gè)月的主動(dòng)免疫大鼠過(guò)程中觀察到：有相當(dāng)數(shù)量的大鼠出現(xiàn)了腹水和肝緣變鈍的現(xiàn)象，引起本研究的極大關(guān)注。對(duì)于腹水的臨床檢驗(yàn)結(jié)果表明：腹水中細(xì)胞數(shù)及蛋白水平偏高，葡萄糖水平偏低，同時(shí)腹水可以自然凝固，基于以上性質(zhì)確定該腹水為滲出液，而非漏出液；同時(shí)結(jié)合大鼠的心功能狀況判定，腹水不是由于心衰而導(dǎo)致的，那么形成腹水的原因是什么，尚不得而知；但結(jié)合肝緣變鈍這一大體現(xiàn)象，考慮肝

16、臟病變可能是形成腹水的原因之一，但不能排除腎臟在免疫過(guò)程中是否也受到損傷。因此在本課題中，也將對(duì)這一問(wèn)題進(jìn)行初步探索。 綜上所述，本課題擬進(jìn)行以下三方面的研究： ①采用被動(dòng)免疫模型，探討抗β1-AR-ECⅡ抗體長(zhǎng)期存在是否會(huì)導(dǎo)致心肌組織CaMKⅡδ表達(dá)的改變，同時(shí)觀察心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平的變化；觀察抗β1-AR-ECⅡ抗體致心律失常的直接作用、長(zhǎng)期作用及其可能的機(jī)制； ②建立主動(dòng)及被動(dòng)免疫模型，觀察抗β1-AR-