Twist基因干擾抑制視網(wǎng)膜新生血管細(xì)胞轉(zhuǎn)型的機(jī)制研究.pdf

1、目的： 通過(guò)RNA干擾技術(shù)抑制小鼠視網(wǎng)膜新生血管形成過(guò)程中Twist基因的表達(dá)，觀察視網(wǎng)膜新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移變化和細(xì)胞轉(zhuǎn)型規(guī)律，尋找抑制視網(wǎng)膜新生血管發(fā)生的新靶點(diǎn)。 方法： 一、小鼠視網(wǎng)膜新生血管動(dòng)物模型的建立 高氧誘導(dǎo)組：使用健康性成熟清潔級(jí)C57BL/6J小鼠雌雄同籠飼養(yǎng)，取其所生幼鼠制作動(dòng)物模型，新生幼鼠出生后第7天入75％濃度高氧環(huán)境中飼養(yǎng)5天，第12天回普通大氣環(huán)境中飼養(yǎng)。 正常對(duì)照

2、組：新生幼鼠于普通大氣環(huán)境中相同條件飼養(yǎng)。 二、小鼠玻璃體腔siRNA質(zhì)粒顯微注射 剛出氧箱的12日齡幼鼠以鹽酸氯胺酮和鹽酸氯丙嗪腹腔內(nèi)注射麻醉，手術(shù)顯微鏡直視下于眼球赤道部用33G針頭穿刺進(jìn)入玻璃體腔，注入siRNA質(zhì)粒溶液1μl。 三、實(shí)驗(yàn)分組 取健康C57BL/6J新生小鼠40只，性別不限，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為四組。 正常對(duì)照組：11只，新生幼鼠于普通大氣環(huán)境中飼養(yǎng)。 高氧誘導(dǎo)組：1

3、1只，新生幼鼠出生后第7天入高氧環(huán)境中飼養(yǎng)5天，第12天回普通大氣環(huán)境中飼養(yǎng)。 Twist干擾質(zhì)粒組：9只，高氧誘導(dǎo)組小鼠第12天出箱時(shí)雙眼玻璃體腔注射pTwist．siRNA質(zhì)粒溶液1μl。 對(duì)照質(zhì)粒組：9只，高氧誘導(dǎo)組小鼠第12天出箱時(shí)雙眼玻璃體腔注射無(wú)關(guān)對(duì)照siRNA質(zhì)粒溶液1μl。 四、檢測(cè)項(xiàng)目 小鼠生后第12天，正常對(duì)照組和高氧誘導(dǎo)組各取2只小鼠（4只眼球）行視網(wǎng)膜伊文思藍(lán)灌注鋪片。小鼠生后第

4、17天每組取3只小鼠（6只眼球）行視網(wǎng)膜伊文思藍(lán)灌注鋪片。 小鼠生后第17天每組取6只小鼠（6只眼球）行組織病理學(xué)檢查、新生血管內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)和免疫組織化學(xué)檢測(cè)，每組取6只小鼠（6只眼球）視網(wǎng)膜行totalRNA提取和Real－Time PCR檢測(cè)。 結(jié)果： 一、小鼠視網(wǎng)膜伊文思藍(lán)灌注鋪片觀察 正常對(duì)照組小鼠生后第12天視網(wǎng)膜血管已分布完全，第17天更加致密；高氧誘導(dǎo)組小鼠生后第12天視網(wǎng)膜血管分布稀疏，可

5、見大片無(wú)灌注區(qū)，第17天血管迂曲滲漏，大量新生血管生長(zhǎng)，無(wú)灌注區(qū)稍縮??；Twist干擾質(zhì)粒組小鼠第17天視網(wǎng)膜血管迂曲滲漏減輕，新生血管明顯減少；對(duì)照質(zhì)粒組小鼠第17天仍有明顯的血管迂曲滲漏和大量新生血管。 二、視網(wǎng)膜組織石蠟切片HE染色觀察 組織切片HE染色觀察，正常對(duì)照組視網(wǎng)膜內(nèi)界膜平滑完整，未見突出內(nèi)界膜的血管芽；高氧誘導(dǎo)組見大量突出內(nèi)界膜伸向玻璃體腔的新生血管芽；Twist干擾質(zhì)粒組突出內(nèi)界膜的新生血管芽數(shù)量和體

6、積較高氧組都明顯減少；對(duì)照質(zhì)粒組可見仍有較多的突出內(nèi)界膜伸向玻璃體腔的新生血管芽。 三、突破內(nèi)界膜的視網(wǎng)膜新生血管內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù) 光鏡下觀察并計(jì)數(shù)突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核，即新生血管內(nèi)皮細(xì)胞，單因素方差分析（LSD法）結(jié)果顯示各組之間計(jì)數(shù)差異存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Twist干擾質(zhì)粒組細(xì)胞計(jì)數(shù)較高氧誘導(dǎo)組顯著減少。 四、石蠟切片免疫組織化學(xué)檢測(cè) 正常對(duì)照組小鼠視網(wǎng)膜Twist和波形蛋白表達(dá)微弱，VE-鈣黏蛋白

7、在視網(wǎng)膜內(nèi)微血管壁表達(dá)；高氧誘導(dǎo)組小鼠視網(wǎng)膜Twist和波形蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)，VE-鈣黏蛋白表達(dá)較弱；Twist干擾質(zhì)粒組小鼠視網(wǎng)膜Twist和波形蛋白表達(dá)減少，VE-鈣黏蛋白在視網(wǎng)膜內(nèi)微血管壁表達(dá)；對(duì)照質(zhì)粒組小鼠視網(wǎng)膜Twist和波形蛋白表達(dá)仍較強(qiáng)，VE-鈣黏蛋白表達(dá)較弱。 五、Real-lime PCR檢測(cè)目的基因的表達(dá) 使用Real-Time PCR方法檢測(cè)各組小鼠第17天視網(wǎng)膜Twist基因和波形蛋白基因的表達(dá)，

8、單因素方差分析（LSD法）顯示各組間表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高氧誘導(dǎo)組表達(dá)較正常對(duì)照組上調(diào)，Twist干擾質(zhì)粒組表達(dá)較高氧誘導(dǎo)組下調(diào)且與正常對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)照質(zhì)粒組表達(dá)較其他3組均為上調(diào)。 結(jié)論： 在小鼠視網(wǎng)膜新生血管形成過(guò)程中，細(xì)胞轉(zhuǎn)型調(diào)控的Twist基因發(fā)揮重要作用，通過(guò)RNA干擾技術(shù)抑制Twist基因的表達(dá)，可阻遏細(xì)胞轉(zhuǎn)型的發(fā)生，抑制視網(wǎng)膜新生血管的形成。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)型機(jī)制可能在增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生