紫莖澤蘭致薩能奶山羊肝細(xì)胞周期阻滯與凋亡及凋亡通路研究.pdf

1、紫莖澤蘭(Eupatorium adenophorum)作為一種世界性入侵有毒有害雜草，可致家畜一系列中毒表現(xiàn)及病理變化。本試驗旨在探索紫莖澤蘭致薩能奶山羊肝細(xì)胞周期阻滯及肝細(xì)胞凋亡的分子機制。本試驗以16只5-6月齡健康薩熊奶山羊為試驗動物，隨機均分成對照組及試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組，分別飼喂含0％、40％、60％和80％紫莖澤蘭混合日糧3個月，運用透射電鏡（TEM）、DNA梯度法(DNALadder)、DNA原位末端標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)、

2、蛋白印跡法(Western Blot)、熒光定量PCR(qRT-PCR)、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)等實驗手段，研究薩能奶山羊肝細(xì)胞周期阻滯時期與肝細(xì)胞凋亡及凋亡通路分子機理，為紫莖澤蘭毒理學(xué)研究與毒草毒性作用機制提供理論依據(jù)。其研究內(nèi)容如下:
　　1.不同劑量紫莖澤蘭致薩能奶山羊肝細(xì)胞周期阻滯。FCM結(jié)果顯示，與對照組相比，各試驗組肝細(xì)胞S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)極顯著降低（P＜0.01），試驗Ⅱ、Ⅲ組G0/G1期肝細(xì)胞百分?jǐn)?shù)顯著升高(P＜0.0

3、5，P＜0.01)，試驗Ⅰ組變化不顯著(P＞0.05)。各試驗組PI僮隨紫莖澤蘭添加劑量增加而下降，且試驗Ⅱ組顯著降低（P＜0.05）、Ⅲ組極顯著降低（P＜0.01），但試驗Ⅰ組與對照組差異不顯著(P＞0.05)。結(jié)果表明，紫莖澤蘭能致薩能奶山羊肝細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。
　　2.不同劑量紫莖澤蘭致薩能奶山羊肝細(xì)胞凋亡。FCM結(jié)果表明，與對照組相比，試驗Ⅰ組正常細(xì)胞百分比顯著降低(P＜0.05)，試驗Ⅱ、Ⅲ組極顯著降低(P＜0

4、.01)。與對照組相比，試驗組Ⅰ組肝細(xì)胞早、晚期凋亡率顯著升高(P＜0.05)，試驗Ⅱ、Ⅲ組均極顯著升高（P＜0.01）。TUNEL結(jié)果顯示，對照組偶見凋亡肝細(xì)胞，試驗Ⅱ、Ⅲ組發(fā)現(xiàn)大量被FITC標(biāo)記的凋亡肝細(xì)胞。統(tǒng)計5個視野凋亡肝細(xì)胞數(shù)發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，試驗Ⅰ組凋亡肝細(xì)胞百分?jǐn)?shù)顯著升高(P＜0.05)，試驗Ⅱ、Ⅲ組極顯著升高（P＜0.01）。AO/EB雙染顯示:對照組肝細(xì)胞胞核呈均勻綠色，細(xì)胞形態(tài)完整。試驗Ⅱ、Ⅲ組肝細(xì)胞胞核呈亮綠色致

5、密板塊，部分呈橘紅色固縮狀，部分胞核胞膜破損且呈均勻紅色。DAPI染色顯示:對照組肝細(xì)胞胞核體積較大，呈均勻、微弱淡熒光，試驗Ⅱ、Ⅲ組部分肝細(xì)胞染色呈高亮的熒光。DNA ladder結(jié)果顯示:對照組總DNA為一整條完整條帶，未出現(xiàn)明顯DNA ladder，各試驗組均撿出DNA ladder條帶且表現(xiàn)出明顯劑量效應(yīng)。TEM結(jié)果顯示，對照組肝細(xì)胞細(xì)胞核形態(tài)完整，染色質(zhì)分布均勻，試驗Ⅱ、Ⅲ組肝細(xì)胞胞核出現(xiàn)以染色質(zhì)濃縮、聚集并且邊緣化的凋亡特征

6、。
　　3.不同劑量紫莖澤蘭致薩能奶山羊肝細(xì)胞線粒體途徑介導(dǎo)的凋亡。本試驗利用ELISA、Western blot和qRT-PCR方法，對凋亡相關(guān)因子Bax、Bcl-2、Bid、Cyt c、APAF-1、PARP、Fas、FasL和Caspase-3，-8，-9在蛋白和mRNA水平上的表達(dá)進(jìn)行檢測，Caspase活性法檢測Caspase-3，-8，-9活力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紫莖澤蘭致薩能奶山羊慢性中毒后，引起肝細(xì)胞Bax與Bcl-2在m

7、RNA及蛋白水平上分別出現(xiàn)升高與下降，致Bax/Bcl-2比值下降、線粒體Cyt c釋放到胞漿、激活A(yù)PAF-1/Caspase-9凋亡小體形成、Caspase-3與PARP活化而造成線粒體功能紊亂。而Fas、FasL、Caspase-8、Bid未能顯著激活。上述結(jié)果表明，紫莖澤蘭可致肝細(xì)胞經(jīng)線粒體途徑介導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，而外源性凋亡途徑未被激活。
　　通過給飼薩能奶山羊40％、60％和80％三個劑量紫莖澤蘭發(fā)現(xiàn)，紫莖澤蘭可致其肝細(xì)胞