辛伐他汀和非諾貝特對(duì)NAFLD大鼠ATGL酶和TNF-α表達(dá)調(diào)控的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:隨著近年來(lái)人們飲食結(jié)構(gòu)的改變和不良生活方式增加，(NAFLD)的發(fā)病率正逐步上升，是目前最常見的慢性肝病之一。目前我國(guó)普通人群的患病率為10％-16％，全球平均患病率約為10.24％，在肥胖人群中增加到57.5-74％，對(duì)于排除了其他肝病原因的無(wú)癥狀性轉(zhuǎn)氨酶升高，約42-90％是由于NAFLD所引起。NAFLD是一類病理改變類似于酒精性肝病(ALD)但無(wú)過(guò)量飲酒史的以肝細(xì)胞大泡性脂肪變性和脂質(zhì)蓄積為特征的病理綜合癥，包括單純性

2、脂肪肝(simple steatosis)、脂肪性肝炎(NASH)、肝纖維化(hepatic fibrosis)和肝硬化(hepatic cirrhosis)幾個(gè)連續(xù)的病理過(guò)程，部分患者甚至?xí)M(jìn)展至肝癌及肝功能衰竭等終末期肝病。現(xiàn)認(rèn)為NAFLD是代謝綜合征(MS)在肝臟的表現(xiàn)，它與肥胖、2型糖尿病、高脂血癥、高胰島素血癥、高血壓病等密切相關(guān)，嚴(yán)重危害人類健康。
　　 NAFLD的發(fā)病率正在迅猛升高，已成為危害人類健康最常見的慢性

3、肝臟疾病之一。然而其明確的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，還停留在假說(shuō)階段。目前較公認(rèn)的是1998年Day提出的“二次打擊”學(xué)說(shuō)。該學(xué)說(shuō)認(rèn)為初次打擊主要指胰島素抵抗(IR)和脂質(zhì)代謝紊亂所導(dǎo)致的肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積，導(dǎo)致肝臟脂肪變性，既為進(jìn)一步的脂質(zhì)過(guò)氧化(LP)反應(yīng)提供了反應(yīng)基質(zhì)，也使肝臟對(duì)各種損傷打擊的易感性增高;二次打擊主要指各種原因在此基礎(chǔ)上所致的氧化應(yīng)激(OS)與脂質(zhì)過(guò)氧化(LP)損傷。1993年腫瘤壞死因子(TNF-α)被認(rèn)為是一種由脂肪細(xì)胞分

4、泌的脂肪因子，亦是脂肪細(xì)胞中最先鑒定出來(lái)的炎癥因子。它在局部脂肪組織中的表達(dá)與肥胖程度有一定正相關(guān)，是介導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的脂源性因子中最重要的一種，可參與肝臟炎癥及纖維化進(jìn)展。而近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，脂肪因子TNF-α在誘導(dǎo)和加重IR有重要作用。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α除可作用于胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，使胰島素受體底物磷酸化受阻，直接引起IR參與“初次打擊”外，還可誘導(dǎo)IL-1、IL-6等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，共同參與肝損害和肝臟炎癥反應(yīng)，并通

5、過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化(LP)使細(xì)胞受損，為“二次打擊”提供了反應(yīng)基質(zhì)。從而促使單純性脂肪肝向脂肪性肝炎和脂肪性肝硬化演變。
　　 NAFLD的典型特征是肝臟脂肪積聚。而甘油三酯(TG)是NAFLD患者肝臟內(nèi)蓄積的主要脂質(zhì)。肝臟攝取的脂肪酸絕大多數(shù)由貯存于脂肪細(xì)胞的脂肪分解而來(lái)，但NAFLD患者的肝臟TG來(lái)源與正常人比較只有60％來(lái)自游離脂肪酸(FFAs)，而25％來(lái)自肝臟自身合成的脂肪酸(DNL)，15％來(lái)自飲食攝入。這提示NAFLD患

6、者肝臟自身合成脂肪酸是增加的，且有數(shù)條通路參與肝臟脂質(zhì)蓄積，其中外周來(lái)源的脂肪酸增多和DNL是NAFLD肝內(nèi)脂肪蓄積的主要因素。TG在肝臟組織中的過(guò)多儲(chǔ)積是NAFLD發(fā)生的先決條件。而肝臟TG的積聚是合成與轉(zhuǎn)化失衡的結(jié)果，這提示在肝臟脂質(zhì)積聚的過(guò)程中可能還存在著TG的分解代謝受限。
　　 長(zhǎng)期以來(lái)，激素敏感脂肪酶(HSL)被認(rèn)為是脂肪分解主要限速酶，但隨著HSL基因敲除小鼠的出現(xiàn)，人們開始猜測(cè)在脂肪細(xì)胞中還存在著其它甘油三酯水解

7、酶。2004年Zimmermann等篩選人和鼠類基因和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，尋找和已知脂肪酶具有同源性的蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了脂肪組織甘油三酯脂酶(ATGL)，不久Jenkins等和Villena等亦同樣發(fā)現(xiàn)了這種蛋白。Zimmermann等利用受轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞證明了ATGL催化甘油三酯水解為甘油二酯，但不水解膽固醇或者視黃醇。ATGL是一種催化甘油三酯第一步水解的重要脂肪酶，而HSL則主要水解甘油二酯，因此ATGL和HSL是脂肪分解反應(yīng)的共同

8、限速酶。而至目前為止，了解到多種因素可調(diào)節(jié)ATGL。比較基因組學(xué)鑒定蛋白58(CGI-58)特異性活化ATGL，在脂肪細(xì)胞中可與ATGL共同作用把甘油三酯水解酶活性提高20倍，從而刺激脂肪的分解，這證明CGI-58對(duì)ATGL酶活性發(fā)揮著重要作用;過(guò)氧化物酶體增殖因子活化受體γ(PPAR-γ)屬于PPAR家族，還包括和PPAR-α，PPAR-β。PPAR-γ可調(diào)節(jié)脂肪代謝的很多方面，包括游離脂肪酸氧化、脂蛋白代謝、脂肪細(xì)胞分化等，其可調(diào)節(jié)

9、細(xì)胞內(nèi)很多脂肪代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)，包括HSL，脂蛋白脂酶(LPL)，脂聯(lián)素等。在一項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)中可發(fā)現(xiàn)，PPAR-γ可促進(jìn)脂肪細(xì)胞ATGL的表達(dá)，并且有實(shí)驗(yàn)證明用PPAR-γ激動(dòng)劑羅格列酮飼喂小鼠，其ATGL和HSL的mRNA和蛋白的表達(dá)都顯著增加;最近一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到，在3T3-L1脂肪細(xì)胞中，TNF-α能明顯降低ATGL mRNA的表達(dá)，并呈時(shí)間和劑量依賴，并且此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中同樣檢測(cè)到了胰島素在對(duì)ATGL的基因表達(dá)調(diào)控上和TNF-α有類似作

10、用。有研究指出，ATGL可表達(dá)于肝臟并通過(guò)增強(qiáng)甘油三酯水解活性而促進(jìn)游離脂肪酸的釋放和氧化，改善肝臟的脂質(zhì)代謝，減輕脂肪肝。因此，ATG與NAFLD的內(nèi)在聯(lián)系是近年來(lái)廣大學(xué)者研究的熱點(diǎn)。
　　 目前，用于治療NAFLD的藥物主要涉及胰島素增敏劑、抗氧化劑、肝細(xì)胞保護(hù)劑、減肥藥、調(diào)脂藥等方面，因高脂血癥是NAFLD發(fā)生的重要血清學(xué)基礎(chǔ)，故調(diào)脂藥物在NAFLD的預(yù)防和治療中的作用也引起了人們的關(guān)注。研究調(diào)脂藥物對(duì)ATGL的基因調(diào)控作

11、用可能為今后治療NAFLD提供了新的思路。
　　 第一部分NAFLD大鼠血清ATGL酶活性及TNF-α水平的變化分析
　　 目的:以高脂飼料建立非酒精性脂肪肝病(NAFLD)大鼠模型，檢測(cè)在大鼠NAFLD發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中血清脂肪組織甘油三酯脂酶(ATGL)酶活性與腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平的變化，以及ATGL與TNF-α的關(guān)系，從而更好地了解非酒精性脂肪肝病的發(fā)病機(jī)理。
　　 方法:78只7周齡雄性SD大

12、鼠(210-230g)隨機(jī)分為正常對(duì)照組（15只）和NAFLD模型組（63只）。以高脂飼料喂養(yǎng)NAFLD模型組大鼠，普通飼料喂養(yǎng)正常對(duì)照組大鼠。25g/鼠／天，自由飲水，維持喂養(yǎng)12周。于12周末，將所有大鼠禁食不禁水12小時(shí)后，由內(nèi)眥采血2ml，檢測(cè)血清甘油三酯(TG)，總膽固醇(TC)，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)及空腹血糖(FBG)。同時(shí)用高度敏感的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒，檢測(cè)血清脂肪組織甘油三酯脂酶(

13、ATGL)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平。以10％水合氯醛(0.5ml/100g)對(duì)大鼠行腹腔麻醉，處死正常對(duì)照組大鼠2只和NAFLD組3只，取肝臟行病理學(xué)檢測(cè)。
　　 結(jié)果:
　　 1.經(jīng)高脂飼料持續(xù)性喂養(yǎng)12周后，發(fā)現(xiàn)NAFLD模型組大鼠出現(xiàn)肥胖，腹部脂肪增多，且血清TG、TC、FBG、ALT、AST較正常對(duì)照組明顯升高，病檢時(shí)發(fā)現(xiàn)模型組大鼠肝臟增大、肝內(nèi)脂質(zhì)沉積并伴有肝組織大泡性脂肪變性及肝小葉內(nèi)和匯管區(qū)炎癥

14、細(xì)胞浸潤(rùn)及不同程度的肝細(xì)胞壞死等脂肪肝特征性病理改變。該模型與人類肥胖和／或糖尿病、高脂血癥所致NASH的病理學(xué)改變極其相似，故從血清學(xué)和病理學(xué)上證實(shí)造模成功;
　　 2.造模12周后，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠血清TNF-α水平較對(duì)照組明顯升高，ATGL酶濃度顯著下降;
　　 3.在大鼠NAFLD發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中，血清TNF-α與ATGL呈高度負(fù)相關(guān)。
　　 結(jié)論:
　　 1.高脂飼料維持飼養(yǎng)12周后可成功構(gòu)建NA

15、FLD大鼠模型;
　　 2.在NAFLD大鼠模型中，TNF-α呈高水平狀態(tài)，而ATGL酶活性降低，且兩者間呈高度負(fù)相關(guān)，這提示在NAFLD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中TNF-α與ATGL可能發(fā)揮著重要作用。
　　 第二部分辛伐他汀和非諾貝特對(duì)NAFLD大鼠ATGL mRNA表達(dá)及酶活性的影響
　　 目的:以高脂飼料建立非酒精性脂肪肝病(NAFLD)大鼠模型，觀察辛伐他汀和非諾貝特對(duì)大鼠NAFLD的治療效果及其對(duì)肝臟組織脂肪組

16、織甘油三酯脂酶(ATGL) mRNA的表達(dá)、血清ATGL酶活性及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平的影響。從而進(jìn)一步完善NAFLD的發(fā)病機(jī)制及探索其治療方法。
　　 方法:78只7周齡雄性SD大鼠(210-230g)隨機(jī)分為正常對(duì)照組（15只）和NAFLD模型組（63只）。以高脂飼料喂養(yǎng)NAFLD模型組大鼠，普通飼料喂養(yǎng)正常對(duì)照組大鼠。25g/鼠／天，自由飲水，維持喂養(yǎng)12周后，從血清學(xué)和病理學(xué)上證實(shí)造模成功后，將余下的模型組大

17、鼠均分為4組:(1)NAFLD模型對(duì)照組15只，(2)辛伐他汀治療組15只，(3)非諾貝特治療組15只，(4)飲食治療組15只。對(duì)大鼠行灌胃治療，其中，給予辛伐他汀治療組大鼠:辛伐他汀4mg·kg-1·d-1;給予非諾貝特治療組大鼠:非諾貝特40 mg·kg-1·d-1;給予飲食治療組等量生理鹽水。16周末，以10％水合氯醛(0.5mg/100g)麻醉所有大鼠，經(jīng)下腔靜脈放血處死所有動(dòng)物，檢測(cè)血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、谷丙

18、轉(zhuǎn)氨酶(ALT)及谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、空腹血糖(FBG)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)。稱取各組大鼠肝濕重，計(jì)算肝指數(shù)，并通過(guò)病理學(xué)檢測(cè)觀察各組大鼠肝臟病理變化。同時(shí)用高度敏感的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒，檢測(cè)血清脂肪組織甘油三酯脂酶(ATGL)及腫瘤壞死因子-α（TNF-(α)，另外，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)檢測(cè)各組大鼠肝臟中脂肪組織甘油三酯脂酶(ATGL) mRNA的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　

19、1.經(jīng)高脂飼料持續(xù)性喂養(yǎng)12周后，NAFLD模型組大鼠出現(xiàn)肥胖，腹部脂肪增多，高脂血癥，肝功能異常，且肝臟增大、肝內(nèi)脂質(zhì)沉積并伴有肝組織大泡性脂肪變性及肝小葉內(nèi)和匯管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及不同程度的肝細(xì)胞壞死等脂肪肝特征性病理改變?？崭寡浅噬呲厔?shì)。該模型與人類肥胖和／或糖尿病、高脂血癥所致NASH的病理學(xué)改變極其相似，故從血清學(xué)和病理學(xué)上證實(shí)造模成功;
　　 2.經(jīng)辛伐他汀和非諾貝特灌胃治療4周后，與NAFLD模型對(duì)照組相比，兩藥

20、物治療組TG、TC、FBG、ALT、AST、BUN、Scr明顯下降，肝臟體積減小，肝臟病理檢測(cè)可見脂質(zhì)沉積狀態(tài)減輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少;
　　 3.經(jīng)4周灌胃治療后，兩藥物組大鼠TNF-α水平較NAFLD模型對(duì)照組大鼠明顯下降，且兩藥物組大鼠肝臟ATGL mRNA表達(dá)上調(diào)及血清ATGL酶濃度顯著增強(qiáng)，而兩藥物組組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;
　　 4.飲食治療組大鼠脫離高脂飲食4周后，血清TC、ALT較模型對(duì)照組大鼠明顯下降，但與

21、兩藥物組相比仍存在差異，病理顯示飲食治療組大鼠肝臟脂質(zhì)沉積情況雖較模型組有所好轉(zhuǎn)，但仍有小泡性脂肪滴，伴少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)和壞死肝細(xì)胞，而血清TNF-α水平及ATGL mRNA表達(dá)及酶活性較模型組無(wú)明顯差異;
　　 5.在NAFLD發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中，血清TNF-α與ATGL呈高度負(fù)相關(guān)。
　　 結(jié)論:
　　 1.在大鼠NAFLD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，TNF-α呈高水平狀態(tài)，可能通過(guò)下調(diào)ATGL mRNA表達(dá)進(jìn)一步影響AT