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文檔簡(jiǎn)介
1、HIV的中和抗體是指可以與HIV病毒特異結(jié)合并且阻斷病毒侵入細(xì)胞的抗體,它在控制HIV感染中起重要作用。HIV中和抗體的靶位是病毒的膜蛋白上那些與細(xì)胞受體結(jié)合并和膜融合有關(guān)的區(qū)域,抗體的結(jié)合與相關(guān)蛋白的構(gòu)象緊密相關(guān)。HIV-1的包膜蛋白gp120對(duì)病毒侵入起重要作用,也是抑制HIV-1感染的中和抗體的主要作用靶點(diǎn)。gp120的V3區(qū)與病毒結(jié)合宿主細(xì)胞密切相關(guān),該區(qū)域集中了多個(gè)中和抗體表位。有研究發(fā)現(xiàn)包膜蛋白V2區(qū)的突變可以增強(qiáng)中和抗體對(duì)
2、HIV-1的中和作用,但是相關(guān)的細(xì)節(jié)和機(jī)制還不明確。過(guò)去的研究得到一個(gè)自然培養(yǎng)中出現(xiàn)的V2區(qū)突變型病毒,L175P env。該V2突變顯著提高了V3中和抗體KD-247對(duì)病毒的中和能力,但是目前還不清楚這個(gè)突變是否普遍影響V3區(qū)與抗體的結(jié)合,以及這種影響的發(fā)生機(jī)制。
第一部分將重組有HIV野生型JR-FL株的包膜蛋白基因Env的真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pJR-FL WT env或突變型質(zhì)粒pJR-FL L175P env、重組有骨
3、架蛋白基因的真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pSG3和轉(zhuǎn)染表達(dá)促進(jìn)質(zhì)粒pRSV-Rev,共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,從而獲得突變株和野生株假病毒。將假病毒與系列稀釋的中和抗體、TZM-b1細(xì)胞混合并孵育,然后檢測(cè)病毒感染能力的降低和抗體中和病毒的百分比,獲得中和抗體半數(shù)抑制濃度(IC50),研究V2突變對(duì)假病毒JR—FL的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)數(shù)種V3中和抗體在較高濃度下方可中和野生株JR-FL WT假病毒;對(duì)V2突變株JR-FL L175P中和活性顯著提高,在非常
4、低的濃度下即可中和該病毒。0.5γ、KD-247、717G2和5G2與JR-FL WT的IC50值分別為4.0252μg/ml、12.2132μg/ml、10.8875μg/ml和7.6555μg/ml,而與JR-FL L175P的IC50值分別為<0.0016μg/ml、0.0024μg/ml、0.0061μg/ml和<0.0016μg/ml,所需中和抗體濃度的數(shù)量級(jí)相差103倍。本實(shí)驗(yàn)證明V2區(qū)突變L175P可以改變多個(gè)V3區(qū)特異性
5、中和抗體對(duì)病毒的中和能力。
第二部分使用質(zhì)粒pJR-FL WT env或pJR—FL L175P env、pSG3和pRSV-Rev,共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,使用0.5%NP40裂解細(xì)胞,獲得突變株和野生株gp120單體。在ELISA檢測(cè)中,用抗人C5單克隆抗體包被96孔板,將突變株和野生株gp120單體分別與V3中和抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人免疫球蛋白G、磷酸鹽底物反應(yīng),測(cè)定各孔A405值,繪制gp120單體與V3中和抗體
6、的結(jié)合圖,比較JR-FL WT gp120單體和JR—FL L175P gp120單體與不同V3中和抗體結(jié)合力的差異。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)gp120單體與各種V3中和抗體結(jié)合實(shí)驗(yàn)的ELISA曲線基本相同。V3抗體0.5γ、KD-247、717G2和5G2與野生株gp120單體結(jié)合曲線和突變株結(jié)合曲線基本重疊,所需中和抗體濃度基本相同。這些結(jié)果證明了V3中和抗體對(duì)gp120蛋白單體的結(jié)合力不因V2區(qū)突變而改變。
第三部分使用真核細(xì)胞表達(dá)
7、質(zhì)粒串聯(lián)HIV-1的env基因和綠色熒光蛋白GFP,并轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,使gp120三聚體蛋白表達(dá)到293T細(xì)胞的表面,并根據(jù)GFP熒光來(lái)檢出轉(zhuǎn)染成功細(xì)胞。被轉(zhuǎn)染細(xì)胞分別與V3中和抗體、PE-Cy5熒光標(biāo)記的鼠抗人IgG抗體孵育,然后使用免疫染色和雙熒光流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)幾種常見(jiàn)V3區(qū)中和抗體對(duì)野生型和突變型gp120蛋白的結(jié)合力指標(biāo):平均熒光強(qiáng)度(MFI)等量化指標(biāo)。發(fā)現(xiàn)該V2區(qū)突變導(dǎo)致了gp120另一結(jié)構(gòu)區(qū),V3區(qū)的中和抗體對(duì)HIV-1
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