豬基因組中拷貝數(shù)變異分析及多聚腺苷酸化位點(diǎn)的發(fā)掘.pdf

1、1.利用基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)分析中外豬品種馴化過程中的拷貝數(shù)變異
　　在野豬到家豬的馴化和進(jìn)一步形成品種的過程中，遺傳、變異和選擇在不同程度上，對(duì)品種的形成以及品種差異的產(chǎn)生起著一定的作用。通過研究家豬與野豬及家豬不同品種之間基因組序列的差異，可以發(fā)現(xiàn)基因組上的變異。拷貝數(shù)變異(copynumber variation，CNV)是指與生物正常的基因序列相比，基因組中所發(fā)生的長(zhǎng)度范圍介于1Kb至數(shù)Mb的變異，其形式包括重復(fù)、缺失及衍生出

2、的復(fù)雜染色體微結(jié)構(gòu)變異。本研究利用豬基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)，對(duì)中外家豬13個(gè)品種共49個(gè)個(gè)體進(jìn)行CNV分析，并分析拷貝數(shù)變異區(qū)域(CNVR)內(nèi)相關(guān)基因的功能。同時(shí)，通過比較中外豬品種在馴化過程中產(chǎn)生的CNV，研究中外豬品種在馴化過程中受到選擇的CNV及其相關(guān)基因，從而發(fā)現(xiàn)中外豬品種表型差異的遺傳基礎(chǔ)。為進(jìn)一步解析豬基因組變異及豬品種改良奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:
　　1.1利用生物信息學(xué)方法分析家豬馴化過程中的CNV。以本實(shí)驗(yàn)室通城豬基因

3、組個(gè)體重測(cè)序數(shù)據(jù)及公共數(shù)據(jù)庫(kù)下載的不同豬品種和野豬共49個(gè)個(gè)體重測(cè)序數(shù)據(jù)為材料，利用CNVseq和CNVnator軟件分別進(jìn)行CNV掃描。發(fā)現(xiàn)，從野豬到家豬馴化過程中產(chǎn)生的CNVRs共有3131個(gè)，其中拷貝數(shù)增加的區(qū)域有745個(gè)、減少的區(qū)域2364個(gè)，增加和減少都存在的區(qū)域有22個(gè);根據(jù)CNVR在基因組上的位置，繪制出豬全基因組CNVs圖譜。
　　1.2利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法驗(yàn)證CNVRs。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)隨機(jī)選取

4、的28個(gè)區(qū)域進(jìn)行拷貝數(shù)的驗(yàn)證，結(jié)果24個(gè)CNVRs的拷貝數(shù)與預(yù)測(cè)CNVRs內(nèi)拷貝數(shù)的增加或減少相符合，驗(yàn)證符合率為86％。
　　1.3 CNV的分布特征分析。對(duì)3131個(gè)CNVRs及上下游10Kb區(qū)域中的重復(fù)元件（SINE、LINE和LTR等）的數(shù)量及分布密度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在CNVRs及上下游10Kb的區(qū)域中，不同重復(fù)元件的分布密度均顯著高于基因組中的平均水平，表明CNV常分布在基因組中重復(fù)元件附近，重復(fù)元件對(duì)CNV發(fā)生有

5、重要影響。
　　1.4家豬馴化過程中CNVR相關(guān)基因的功能分析。利用BioMart工具，在家豬馴化過程中產(chǎn)生的3131個(gè)CNVRs中發(fā)現(xiàn)1266個(gè)編碼蛋白的基因，利用DAVID工具對(duì)基因進(jìn)行功能富集分析，發(fā)現(xiàn)這些基因主要參與細(xì)胞粘附、GTP酶活性、細(xì)胞連接、免疫反應(yīng)、嗅覺和MAPK通路等。
　　1.5中外家豬在馴化過程中產(chǎn)生的差異CNVR及相關(guān)基因功能分析。通過分析發(fā)現(xiàn)，中國(guó)家豬中存在2278個(gè)CNVRs，歐洲家豬中存在17

6、06個(gè)CNVRs。分別特異存在于中外家豬中的CNVRs有129個(gè)和147個(gè)，分別對(duì)CNVRs內(nèi)相關(guān)基因進(jìn)行功能富集分析，結(jié)果顯示，中國(guó)家豬馴化過程中產(chǎn)生的特異CNVRs內(nèi)相關(guān)基因的功能富集在免疫反應(yīng)及生產(chǎn)性狀上;而歐洲家豬馴化過程中產(chǎn)生的特異CNVRs內(nèi)相關(guān)基因的功能富集在肌肉發(fā)育過程。
　　2.利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析豬基因組多聚腺苷酸化位點(diǎn)
　　多聚腺苷酸化是RNA轉(zhuǎn)錄后修飾的一個(gè)重要過程，在mRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)及成熟mRNA的翻譯

7、過程中起到關(guān)鍵作用。一個(gè)基因序列上多聚腺苷酸化位點(diǎn)(polyadenylation site，PAS)的數(shù)量以及每個(gè)PAS的利用程度不同會(huì)引起選擇性多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation，APA)的形成，從而導(dǎo)致同一個(gè)基因產(chǎn)生多個(gè)轉(zhuǎn)錄本，對(duì)基因的表達(dá)及功能的發(fā)揮產(chǎn)生重要影響。本研究利用豬轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從全基因組水平挖掘豬的PAS，通過研究PAS與基因表達(dá)量的關(guān)系，進(jìn)一步研究PAS對(duì)性狀的影響。主要結(jié)果如下:<

8、br>　　2.1基于大規(guī)模轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挖掘豬的多聚腺苷酸化位點(diǎn)。利用本實(shí)驗(yàn)室感染藍(lán)耳病病毒前后的通城豬和大白豬中肺泡巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及公共數(shù)據(jù)庫(kù)下載的豬的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，包括12種組織、細(xì)胞及精子等的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，共計(jì)120億個(gè)reads，其中有194萬個(gè)含有Poly(A)或Poly(T)的reads成功比對(duì)到基因組上，對(duì)這些reads進(jìn)行PAS挖掘，共得到28363個(gè)PASs。
　　2.2對(duì)PAS位置進(jìn)行注釋。依據(jù)目前豬基因組注釋文

9、件中基因的位置信息，對(duì)本研究得到的28363個(gè)PASs進(jìn)行位置注釋，共發(fā)現(xiàn)13033個(gè)(47％) PASs位于7403個(gè)基因中，其中有7900個(gè)PASs(61％)位于基因的3'UTR，3441個(gè)PASs(26％)位于基因的內(nèi)含子區(qū)域，2187個(gè)PASs(17％)位于基因的ORF區(qū)域;利用所有轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)豬的新轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行預(yù)測(cè)，并對(duì)剩余的15330個(gè)PASs進(jìn)行位置注釋，結(jié)果表明，有6806個(gè)(24％) PASs位于預(yù)測(cè)的新轉(zhuǎn)錄本內(nèi)部。即:

10、利用基因組注釋文件和預(yù)測(cè)新的轉(zhuǎn)錄本信息，共發(fā)現(xiàn)19839個(gè)PASs(70％)位于基因內(nèi)部區(qū)域，8524個(gè)PASs(30％)位于基因間區(qū)域。
　　2.3 PAS在基因組和不同組織中的分布特性?；谪i基因組注釋文件中基因的位置信息，對(duì)基因及其3'UTR內(nèi)的PAS分布進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，近41％的基因中存在至少兩個(gè)以上的PASs，這些PAS可促使同一基因產(chǎn)生多個(gè)轉(zhuǎn)錄本;而對(duì)基因內(nèi)及其3'UTR中相鄰PASs間的距離分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)PAS

11、s(45％)間的距離很近(＜1Kb);對(duì)3'UTR中的PAS與終止子間的距離分析發(fā)現(xiàn)，PAS在3，UTR上的位置具有較大差異，該距離的中值為307nt;通過對(duì)肝臟及睪丸組織中PAS進(jìn)行挖掘，分別得到12777和14375個(gè)PASs，而兩個(gè)組織相同的PAS僅有4752個(gè)，占總數(shù)量的21％，并且，兩個(gè)組織中相同PAS的利用率差異很大，說明PAS具有組織特異性。
　　2.4利用Pearson方法對(duì)PAS和基因表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析。本研究

12、利用源于不同雄性激素水平的睪丸和肝臟組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)每個(gè)數(shù)據(jù)中基因的表達(dá)量、相應(yīng)基因內(nèi)PAS的數(shù)量及覆蓋的reads數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，利用Pearson方法對(duì)PAS與基因表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，基因內(nèi)PAS數(shù)量與基因表達(dá)量呈中度正相關(guān)(0.4＜r＜0.6，p＜0.01)，PAS覆蓋的reads數(shù)與基因表達(dá)量呈強(qiáng)正相關(guān)(0.6＜r＜0.8，p＜0.01)。
　　2.5 PAS利用率對(duì)雄性激素水平及在細(xì)菌感染機(jī)體過程中的作用分析

13、。依據(jù)睪丸和肝臟組織中雄性激素水平的高低，對(duì)不同數(shù)據(jù)中挖掘的PAS進(jìn)行差異利用率分析，結(jié)果表明，肝臟中有272個(gè)PASs在低雄性激素組中的利用率顯著高于在高雄性激素組中利用率(p＜0.05，|log2FC|≥1)，對(duì)差異利用率PAS所在的109個(gè)基因進(jìn)行功能富集分析發(fā)現(xiàn)，這些基因參與到了固醇及脂肪酸的代謝、甾類激素的合成和細(xì)胞色素P450的代謝等過程(p＜0.05);在睪丸中，有260個(gè)PASs的利用率具有極顯著差異的(p＜0.05，|

14、log2FC|≥1)，相應(yīng)的基因有163個(gè)，基因功能富集分析表明，很多基因同時(shí)參與精子形成和細(xì)胞周期等過程(p＜0.05)。對(duì)感染沙門氏菌前后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行PAS分析，發(fā)現(xiàn)38個(gè)PASs在感染后有較高的利用率，相關(guān)基因有28個(gè)，而41個(gè)PAS在感染前有較高的利用率，相關(guān)基因有26個(gè)(p＜0.05，|log2FC|≥1)。分別對(duì)感染前后高利用率PAS的相關(guān)基因進(jìn)行功能富集分析，結(jié)果顯示，感染后高利用率PASs的相關(guān)基因參與免疫應(yīng)答和細(xì)胞