丙炔苯丙胺對(duì)MPP+誘導(dǎo)的帕金森病PC12細(xì)胞模型的保護(hù)機(jī)制研究.pdf

1、第一部分丙炔苯丙胺通過(guò)上調(diào)抗氧化蛋白NQO1表達(dá)保護(hù)1-甲基-4-苯基吡啶離子所致PC12細(xì)胞損傷
　　 目的:本部分研究旨在帕金森?。≒D）的PC12細(xì)胞模型中證實(shí)丙炔苯丙胺的神經(jīng)保護(hù)作用，并對(duì)其保護(hù)機(jī)制進(jìn)行初步探索。
　　 方法:應(yīng)用1-甲基-4-苯基吡啶離子（MPP+）處理PC12細(xì)胞制備PD的細(xì)胞模型。采用四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT 法）、細(xì)胞乳酸脫氫酶（LDH）釋放量檢測(cè)、活性氧蔟（ROS）含量檢測(cè)、四唑氮藍(lán)

2、/甘氨酸鹽法行醌結(jié)合蛋白檢測(cè)、Western Blots等方法檢測(cè)丙炔苯丙胺對(duì)MPP+所致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，初步探索丙炔苯丙胺是否通過(guò)間接的抗氧化作用發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)。
　　 結(jié)果:MTT 法和LDH 釋放量檢測(cè)均顯示，不同濃度丙炔苯丙胺預(yù)處理可以顯著減輕MPP+導(dǎo)致的PC12細(xì)胞損傷。ROS 含量測(cè)定以及四唑氮藍(lán)/甘氨酸鹽法醌蛋白濃度檢測(cè)的結(jié)果顯示，不同濃度丙炔苯丙胺預(yù)處理明顯地逆轉(zhuǎn)了MPP+導(dǎo)致的氧化應(yīng)激標(biāo)志物增高

3、。Western blots 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)輔酶Ⅰ醌類氧化還原酶1（NQO1）蛋白表達(dá)及二氯靛酚反應(yīng)法測(cè)定NQO1 活性的結(jié)果顯示，不同濃度的丙炔苯丙胺可以導(dǎo)致該抗氧化蛋白的表達(dá)量和酶活性均呈現(xiàn)出劑量依賴式的增高。另外，LDH 釋放量檢測(cè)結(jié)果顯示，雙香豆素抑制NQO1后，丙炔苯丙胺對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用被逆轉(zhuǎn)了。
　　 結(jié)論:丙炔苯丙胺可以通過(guò)上調(diào)抗氧化蛋白NQO1的表達(dá)和活性，減少氧化應(yīng)激損傷標(biāo)志物的生成，發(fā)揮對(duì)MPP+所致的PC12細(xì)

4、胞損傷的保護(hù)作用。
　　 第二部分丙炔苯丙胺通過(guò)促進(jìn)Nrf2 核轉(zhuǎn)位介導(dǎo)PC12細(xì)胞抗氧化蛋白NQO1表達(dá)和活性增高
　　 目的:驗(yàn)證丙炔苯丙胺是否通過(guò)促進(jìn)核因子紅系2 相關(guān)因子2（Nrf2）核轉(zhuǎn)位介導(dǎo)PC12細(xì)胞抗氧化蛋白NQO1表達(dá)和酶活性增高。
　　 方法:應(yīng)用細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒分別提取PC12細(xì)胞的胞漿胞核蛋白，再采用Western blots 技術(shù)檢測(cè)胞漿胞核中Nrf2的蛋白含量變化；采用

5、Nrf2 小分子干擾RNA（SiRNA）轉(zhuǎn)染技術(shù)，進(jìn)一步驗(yàn)證Nrf2在丙炔苯丙胺誘導(dǎo)NQO1 酶活性上調(diào)過(guò)程中的作用。
　　 結(jié)果:Western blots 結(jié)果表明，在MPP+的單獨(dú)處理下，PC12細(xì)胞胞漿和胞核的Nrf2 含量都出現(xiàn)了減少。而丙炔苯丙胺預(yù)處理可以有效地減少胞漿內(nèi)的Nrf2 含量，增加核內(nèi)Nrf2的含量，且其胞漿內(nèi)Nrf2的相對(duì)表達(dá)水平比MPP+單獨(dú)處理時(shí)還要低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在轉(zhuǎn)染了Nrf2 SiRN

6、A的PC12細(xì)胞中，NQO1的活性出現(xiàn)了明顯降低。另外，在Nrf2基因被沉默后，丙炔苯丙胺所導(dǎo)致的NQO1 酶活性上調(diào)也消失了。
　　 結(jié)論：丙炔苯丙胺所導(dǎo)致的抗氧化蛋白NQO1 酶活性增強(qiáng)是通過(guò)促進(jìn)Nrf2 核轉(zhuǎn)位，從而驅(qū)動(dòng)NQO1 轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)這一途徑完成的。
　　 第三部分 Akt和Erk 信號(hào)通路在丙炔苯丙胺抗氧化應(yīng)激介導(dǎo)的PC12細(xì)胞保護(hù)機(jī)制中的作用
　　 目的：本部分研究旨在探索丙炔苯丙胺促進(jìn)Nrf2 核

7、轉(zhuǎn)位的上游激酶調(diào)控通路，并觀察丙炔苯丙胺對(duì)B 型單胺氧化酶（MAOB）的抑制作用是否也參與了Nrf2的激活過(guò)程。
　　 方法：應(yīng)用Western Blots 方法檢測(cè)PC12細(xì)胞中Akt和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（Erk）等激酶的磷酸化水平變化，并應(yīng)用各種激酶抑制劑處理PC12細(xì)胞觀察各個(gè)激酶對(duì)Nrf2和NQO1的調(diào)控作用。另外，我們應(yīng)用MAOB和Nrf2 SiRNA 轉(zhuǎn)染，來(lái)分析丙炔苯丙胺對(duì)MAOB 抑制作用是否影響了Nrf2 介導(dǎo)

8、的抗氧化反應(yīng)。
　　 結(jié)果：經(jīng)過(guò)Western blots 法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，丙炔苯丙胺處理PC12細(xì)胞可以誘導(dǎo)Akt和Erk的磷酸化水平呈時(shí)間依賴性增高。另外，丙炔苯丙胺介導(dǎo)的Nrf2 核轉(zhuǎn)位和NQO1表達(dá)增高被可以被PD98059 部分阻斷，而PI3K的抑制劑LY294002 幾乎完全地取消了丙炔苯丙胺導(dǎo)致的Nrf2 核轉(zhuǎn)位和NQO1表達(dá)增高。對(duì)SiRNA 轉(zhuǎn)染的PC12細(xì)胞的ROS測(cè)定表明，MAOB基因沉默可以使ROS 含量出現(xiàn)