葫蘆素B與吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用對(duì)胰腺癌的抑制作用及其機(jī)理研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 胰腺癌是一種常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，世界上每年胰腺癌新發(fā)病例約為21.6萬(wàn)人，占全部惡性腫瘤的2％，但是胰腺癌的死亡率非常高，與發(fā)病率十分接近，在癌癥死因中占第4位。胰腺癌的治療仍然是非常棘手的臨床問(wèn)題。手術(shù)切除是目前首選的治療方式，但由于受胰腺解剖學(xué)及生物學(xué)特征等因素的影響，確診時(shí)多屬晚期，手術(shù)切除的機(jī)會(huì)只有15％～20％甚至更低，而且術(shù)后仍有復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。近年來(lái)，胰腺癌的藥物治療已經(jīng)有了顯著的進(jìn)步，

2、化療已成為必不可少的治療手段之一，分子靶向藥物治療也已成為目前研究的熱點(diǎn)。 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(signal transducers and activators of transcription，STATs)是1992年研究干擾素誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄時(shí)首次鑒定的一個(gè)胞漿蛋白家族，是根據(jù)它們?cè)谛盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用來(lái)命名的，它們接收特異的細(xì)胞表面受體信號(hào)并進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而使細(xì)胞內(nèi)其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)生改變。迄今為止，人們已經(jīng)確認(rèn)了7種不同的

3、STAT分子，包括STAT1、2、3、4、5a、5b和6。STAT3是其重要成員，在許多人類腫瘤中活化，具有強(qiáng)烈的抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，參與了人類惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。近年來(lái)，以STAT3為靶點(diǎn)的治療措施取得了很大進(jìn)展，通過(guò)直接或間接阻斷STAT3信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞和異種移植瘤的STAT3活化，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡。 葫蘆素(Cucurbitacins)是從葫蘆科及其它科屬多種植物中提取的成分，至今已發(fā)現(xiàn)40

4、多種，其中以葫蘆素B、E應(yīng)用最廣。葫蘆素具有抗腫瘤、抗化學(xué)致癌、保肝、提高機(jī)體免疫力等多種生物活性。近年的多項(xiàng)研究表明，葫蘆素B、D、E、I、Q等是JAK/STAT3信號(hào)通路的特異抑制劑，能降低多種癌細(xì)胞的STAT3活化水平，并降低STAT3的DNA結(jié)合能力和STAT3介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制異種移植瘤生長(zhǎng)。J ayaprakasam等報(bào)道，葫蘆素B對(duì)結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤都有明顯的抑制作

5、用。我們前期的研究顯示葫蘆素B對(duì)喉癌和肝癌也具有增殖抑制作用，但關(guān)于葫蘆素B對(duì)胰腺癌的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。 吉西他濱(gemcitabine，difluorodeoxycytidin，dFdC)是晚期胰腺癌的標(biāo)準(zhǔn)治療藥物，但單用吉西他濱對(duì)患者生存期的影響還很有限，因此除了不能耐受強(qiáng)烈化療或參加新藥試驗(yàn)的患者，臨床上經(jīng)常采用聯(lián)合化療治療晚期胰腺癌。目前多采用吉西他濱聯(lián)合其他抗腫瘤藥物，包括：一些傳統(tǒng)藥物如5—氟尿嘧啶、鉑類藥物，新一代

6、細(xì)胞毒藥物如多西紫杉醇以及分子靶向藥物如埃羅替尼等。吉西他濱聯(lián)合化療與其單藥應(yīng)用相比，能夠提高總生存期、客觀緩解率及無(wú)進(jìn)展生存期等，但患者5年生存率仍較低。吉西他濱與分子靶向藥物聯(lián)合是目前研究的熱點(diǎn)，且有關(guān)葫蘆素B與吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用對(duì)胰腺癌抑制作用的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。 本研究應(yīng)用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)、熒光染色、活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測(cè)以及Western blot等方法，研究葫蘆素B單獨(dú)或

7、聯(lián)合吉西他濱對(duì)胰腺癌細(xì)胞系PANC—1體外的增殖抑制作用，并探討其機(jī)理。 材料和方法: 不同濃度葫蘆素B單獨(dú)或聯(lián)合吉西他濱作用于PANC—1細(xì)胞一定時(shí)間后，利用MTT法檢測(cè)計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率并探討兩者聯(lián)合是否具有協(xié)同作用，流式細(xì)胞儀PI單染檢測(cè)細(xì)胞周期分布的變化，Hoechst33258核染色熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化，流式細(xì)胞儀Annexin V/PI雙標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，活性氧探針(2，7—二氯熒光素)探測(cè)

8、PANC—1細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的變化，最后利用Western Blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)p—STAT3及凋亡相關(guān)蛋白Bcl—2、p53及其下游蛋白p21等的表達(dá)。 結(jié)果: 1、MTT法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示葫蘆素B與吉西他濱單獨(dú)或是聯(lián)合應(yīng)用，對(duì)PANC—1細(xì)胞的增殖抑制作用具有明顯的劑量依賴性和時(shí)間依賴性。經(jīng)單因素方差分析，P<0.01。經(jīng)LSD-T檢驗(yàn)，用藥組與對(duì)照組之間、高劑量組與低劑量組之間、不同時(shí)間組之間以及聯(lián)合用藥組與單藥組之

9、間，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或<0.01)。 2、PI單染流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示葫蘆素B導(dǎo)致PANC—1細(xì)胞G2/M期阻滯，同時(shí)伴有G0/G1期細(xì)胞減少，并具有劑量依賴性和時(shí)間依賴性；吉西他濱則使阻滯于S期的細(xì)胞增多；兩者聯(lián)合應(yīng)用，同時(shí)阻滯細(xì)胞于S期和G2/M期，且阻滯細(xì)胞所占比例明顯升高。經(jīng)單因素方差分析，P<0.01。經(jīng)LSD-T檢驗(yàn)，不同劑量組之間、不同時(shí)間組之間及其與對(duì)照組之間、以及聯(lián)合組與單藥組之間的差異均有統(tǒng)

10、計(jì)學(xué)意義(P<0.05或<0.01)。 3、Hoechst33258染色熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，隨著葫蘆素B或吉西他濱濃度增加和作用時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著性改變，凋亡細(xì)胞明顯增多，甚至出現(xiàn)大片細(xì)胞脫落形成細(xì)胞脫失區(qū)，兩藥聯(lián)合應(yīng)用后效果更加明顯。經(jīng)單因素方差分析，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)LSD-T檢驗(yàn)，P<0.05或<0.01。 4、Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥組較陰性對(duì)照組和單藥組細(xì)胞凋亡比例明

11、顯升高。經(jīng)單因素方差分析，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)LSD-T檢驗(yàn)，不同濃度組與對(duì)照組之間、各濃度組之間以及聯(lián)合組與單藥組之間，P<0.01。 5、活性氧探針(2，7—二氯熒光素)檢測(cè)結(jié)果顯示，葫蘆素B或吉西他濱單獨(dú)作用于PANC—1細(xì)胞后胞內(nèi)活性氧水平升高，并呈時(shí)間和劑量依賴性。兩者聯(lián)合作用下細(xì)胞內(nèi)活性氧水平顯著升高。經(jīng)單因素方差分析，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)LSD-T檢驗(yàn)，不同濃度組與對(duì)照組之間、聯(lián)合用藥組與單藥組之間相比較，P<0.01

12、。 6、Western blot結(jié)果顯示葫蘆素B可以時(shí)間和劑量依賴性抑制STAT3的磷酸化和抗凋亡基因Bcl—2的蛋白表達(dá)，活化抑癌蛋白p53和p21的表達(dá)。兩藥聯(lián)合作用，pSTAT3則幾乎完全被抑制，p53蛋白水平表達(dá)較對(duì)照組升高。 結(jié)論: 1、葫蘆素B可以劑量和時(shí)間依賴性抑制胰腺癌PANC—1細(xì)胞的生長(zhǎng)；葫蘆素B和吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用共同抑制PANC—1細(xì)胞的增殖抑制，且作用較單藥明顯。 2、葫蘆素B抑制

13、胰腺癌PANC—1細(xì)胞的作用是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞G2/M期阻滯和凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的，并具有劑量和時(shí)間依賴性；兩藥聯(lián)合作用細(xì)胞同時(shí)阻滯于S期和G2/M期，且阻滯細(xì)胞比例較單藥組明顯增加。 3、葫蘆素B可以劑量依賴性地增加胰腺癌細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生；兩藥聯(lián)合作用，細(xì)胞內(nèi)ROS水平增加顯著。 4、葫蘆素B抑制胰腺癌PANC—1細(xì)胞的作用機(jī)理可能是通過(guò)抑制STAT3信號(hào)通路的活化，進(jìn)而抑制抗凋亡基因Bcl—2的表達(dá)，增強(qiáng)p53和p21蛋白的表